简介:目的:研究柔红霉素产生菌天蓝淡红链霉菌SIPI-1482中酮还原酶基因dnrU阻断后的产物(13s)-13-二氢柔红霉素及其他发酵产物的变化。方法:利用同源重组的原理,以大肠杆菌质粒pUC18为基础构建了dnrU基因交换质粒,通过在SIPI-1482染色体上的dnrU基因中插入安普霉素抗性基因来筛选dnrU的阻断突变株。结果和结论:PCR验证表明成功地阻断了dnrU基因。dnrU基因敲除后,重组菌发酵产物中(13s)-13-二氢柔红霉素消失,而其他发酵中间产物也有一定变化。
简介:目的:检测抗凝血酶Ⅲ(ATⅢ)转基因山羊外源基因的拷贝数及ATⅢ蛋白的表达量,分析拷贝数与蛋白表达量的相关性。方法:用Primer5.0软件设计外源基因ATⅢ及山羊管家基因GAPDH的引物,以倍比稀释的标准品进行实时荧光定量PCR,制作标准曲线,通过标准曲线计算外源基因拷贝数;通过酶显色底物法检测ATⅢ蛋白的含量。结果:依据ATⅢ和GAPDH基因标准曲线方程计算得到的山羊个体间外源基因的拷贝数相差很大,最少的为5,最多为25,且不同转基因山羊间ATⅢ表达水平的差别达10倍以上。结论:外源基因表达水平在受到拷贝数的影响外,也受到整合位点等其他因素的重要影响。
简介:目的:克隆并表达caspase-8/10相关RING结构域蛋白1(CARP1)基因,检测其泛素连接酶活性。方法:提取结肠癌HCT116细胞总RNA,RT-PCR扩增CARP1基因,将其克隆到真核表达载体pcDNA3-Flag中,序列正确的阳性克隆进行扩增,提取质粒转染至293T细胞中进行瞬时表达,通过体内泛素化检测其泛素化酶活性,通过萤光素酶报告基因的方法检测其对NF-kB转录活性的影响,利用细胞生长曲线检测CARP1基因对结肠癌细胞生长的影响。结果:免疫印迹实验表明CARP1基因在293T细胞中获得有效表达;免疫共沉淀实验表明,当CARP1存在时,受体相互作用蛋白1(RIP1)被泛素化;萤光素酶实验结果表明CARP1抑制肿瘤坏死因子a(TNFa)引起的NF-kB报道基因的激活;通过生长曲线发现CARP1能促进结肠癌细胞系HCT116生长,并能部分抵抗顺铂抑制细胞生长的作用。结论:构建的人CARP1基因真核表达载体在293T细胞中获得表达,表达产物具有RIP1泛素连接酶的活性,可抑制TNFa引起的NF-kB报告基因的激活,并且促进结肠癌细胞的生长,为进一步的基因功能研究奠定了基础。
简介:目的:构建猪α-1,3-半乳糖转移酶(GGTA1)基因的正负筛选打靶载体。方法:以原代猪胚胎成纤维细胞基因组DNA为模板,采用长程PCR方法扩增出GGTA1基因的2条片段;以长约2kb包含部分第9外显子的片段为同源短臂,在XbaI和ClaI位点插入pLoxP质粒正筛选标记neo基因的3’端;以长约5.4kb包括部分第8外显子、全部第8内含子及部分第9外显子的片段为同源长臂,于NotI位点插入该质粒中聊D基因的5’端;2.7kb的负筛选标记船基因位于载体中同源短臂的3’端外侧。结果与结论:酶切、PCR及测序结果表明,同源臂被正确连接至质粒pLoxP,成功构建了猪GGTA1基因正负筛选打靶载体pSL/GT。
简介:目的:获得抑制效果好的泛素C端水解酶LI(UCH—L1)基因小干扰RNA(siRNA)干扰载体。方法:根据Gen—Bank中大鼠UCH—L1基因序列设计并合成4对siRNA寡核苷酸序列,将4对寡榱苷酸序列退、k成双链后分别插入siRNA表达载体pcDNA6.2-GW/EmGFP—miR中构建4个siRNA表达质粒,测序鉴定后将4个siRNA表达磺牝分别转染HEK293细胞,利用Western印迹和qPCR方法检测干扰效果;将干扰效果最好的质粒包装成腺病毒,感染大汛血管平滑肌细胞(VSMC),并采用TNF-a干预诱导UCH—Ll表达升高,Western印迹验证干扰效果。结果:测序分析证实4对siRNA寡核苷酸序列分别插入siRNA表达载体pcDNA6.2-GW/EmGFP—miR;qPCR检测与Western印迹均表明第3号siRNA表达载沐对UCH—Ll表达的抑制程度最高,将其包装成腺病毒并转染VSMC能显著抑制TNFd湾导的U(:H—I。l表达升高。结论:构建并筛选出干扰效果好的UCH—LlsiRNA干扰载体。
简介:根据Genbank中大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)基因的核苷酸序列,设计并合成了一对引物,以大肠杆菌基因组DNA为模板,进行PCR扩增,并将扩增产物定向连接到克隆、测序及真核表达载体PCDNA3中,进行酶切鉴定、测序及序列分析。结果表明PCR扩增出741bp大小的片段,通过酶切和序列分析证明含完整的PNP基因序列且基因插入方向正确,此序列与文献报道的PNP基因的同源性为99.7%。说明克隆的PNP基因与文献报道的基本一致,pcDNA3-PNP的构建成功为今后用其进行基因转染来研究PNP/Mep-dR自杀基因系统在肿瘤基因治疗中的应用打下了基础。
简介:目的:构建一个牛dSl酪蛋白调控序列指导人溶菌酶(hLYZ)基因组序列的杂合基因座。方法:采用本实验室发明的连续3步缺口修复技术。将6个无痕连接的同源臂插入以pBR322为载体的骨架中,构成能进行3次连续基因抓捕的载体,利用Red同源重组系统介导的缺口修复技术,分别抓捕牛aSl酪蛋白3’端调控序列(9kb)、hLYZ基因座序列(5kb)、牛axSl酪蛋白5’端调控序列(20kb),使这3个基因片段自动无痕地连接在基因抓捕载体上,形成牛oLSl酪蛋白一hLYZ杂合基因座。结果:实验经过PCR扩增、限制性内切酶酶切验证和序列测定,验证了hLYZ的基因组序列对牛仪S1酪蛋白编码基因组序列的精确置换。结论:这种修复技术为乳腺生物反应器高效表达大载体的制备提供了可行的思路及方法。