简介：摘要目的制备脑炎心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus, EMCV)的3C蛋白酶抗体并检测抗体特异性反应位点。方法构建原核表达载体pQE30-3C，将蛋白进行体外原核表达，免疫纯种BALB/c小鼠，制备单克隆抗体，通过Western blot检测制备的抗体与3C蛋白结合的特异性，通过免疫荧光和Western blot检测抗体与EMCV病毒中表达的3C蛋白酶结合的特异性。原核表达具有不同抗原性的EMCV 3C的3个不同片段，并通过Western blot检测单克隆抗体与EMCV 3C蛋白酶不同片段的反应特异性。结果单克隆抗体与原核表达的3C蛋白酶反应良好，通过Western blot可以检测到病毒中表达的3C蛋白，通过免疫荧光也可以检测到EMCV病毒中的3C蛋白。通过与3C片段的反应发现，单克隆抗体与C端反应，即抗体针对的是C端处的抗原决定簇。结论成功制备EMCV 3C蛋白酶的抗体，能与原核表达的3C蛋白和病毒3C蛋白反应，且针对的是C端的抗原决定簇。

简介：摘要目的构建一种能够验证内部核糖体进入位点的双荧光素酶报告载体，为验证内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site, IRES)活性提供了方法。方法以双荧光素酶报告基因载体psiCHECK-2为基础，将发卡结构插入到海肾荧光素酶(R-Luc)基因与萤火虫荧光素酶(F-Luc)基因之间，构建载体psiCHECK-IRES。为了验证载体是否有效，通过同源重组技术将Encephalomyocarditis virus(EMCV)的IRES序列插入到psiCHECK-IRES载体的发卡结构与F-Luc之间，形成载体psiCHECK-IRES-EMCV。以psiCHECK-2质粒做模板建立F-Luc与R-Luc的扩增标准曲线。将psiCHECK-IRES与psiCHECK-IRES-EMCV质粒转染BHK-21细胞，利用RT-qPCR检测F-Luc与R-Luc的拷贝数；将psiCHECK-IRES与psiCHECK-IRES-EMCV质粒分别转染BHK-21细胞，24 h后利用双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶活性。结果经过测序证实带有发卡样结构的双荧光素酶表达载体psiCHECK-IRES的载体序列。RT-qPCR结果显示F-Luc与R-Luc mRNA的拷贝数大致相同，证明未出现异常的单顺反子转录本，避免F-Luc读数出现假阳性；插入EMCV IRES的psiCHECK-IRES-EMCV载体表达的F-Luc/R-Luc比值是空载体的53.35倍，证明EMCV的IRES序列能够在构建的载体上起始F-Luc基因的表达。结论本研究构建了可用于验证病毒或者细胞依赖IRES表达的双荧光素酶报告载体psiCHECK-IRES。