简介：摘要目的利用CRISPR/Cas9技术构建Crx-iCreERT2红色荧光报告人胚胎干细胞(ESCs)系及其3D视网膜类器官培养。方法对H9细胞系靶位点序列进行PCR扩增并测序验证后，利用CRISPR/Cas9技术设计多条sgRNA并对其进行活性检测，根据活性、特异性等因素选择最合适的sgRNA。经酶切鉴定和测序确认打靶载体构建完成后，将打靶载体电转H9细胞系，在hES-ZLM-001基因Exon4和3’-非翻译区之间终止密码子前插入P2A-tdTomato-P2A-iCreERT2，进行药物筛选、阳性克隆富集。设计引物对目标区域进行PCR扩增并测序，根据测序结果和测序峰图选出纯合去抗性敲进阳性细胞克隆。培养所得1-A07细胞系，通过流式细胞分析法检测OCT4阳性细胞比例，采用细胞爬片免疫荧光染色法观察干细胞标志物SOX2、NANOG和SSEA4表达情况。采用核型分析方法检测细胞核型。应用3D培养技术获得视网膜类器官，于分化后不同时间点行冰冻切片，免疫荧光染色法检测不同种类细胞分子标志物的表达分布情况。结果H9细胞系靶位点序列与Genebank和Ensembl所提供序列一致。根据H9细胞系靶位点序列共设计16条sgRNA，最终选择sgRNA8和sgRNA12作为sgRNA。电转后通过PCR筛选得到4个去抗性敲进阳性克隆，其中1-A07细胞系经流式细胞仪分析OCT4阳性细胞比例约为98.7%，所得细胞系外源性tdTomato-P2A-iCreERT2片段重组位置正确，正常表达干细胞标志物，核型分析结果正常。应用3D培养技术可定向诱导1-A07细胞系分化为表达tdTomato红色荧光的视网膜类器官。分化后30 d，出现BRN3A阳性神经节细胞、CALBINDIN阳性水平细胞、CHAT阳性无长突细胞，分化后45 d，出现RECOVERIN阳性光感受器细胞，分化后90 d出现PKCα阳性双极细胞。神经节细胞分布于视网膜类器官深层，水平细胞、无长突细胞、双极细胞分布于中深层，光感受器细胞主要分布于顶层。结论成功构建Crx-iCreERT2红色荧光报告人ESCs系，该细胞系可经3D培养诱导分化为表达tdTomato红色荧光的视网膜类器官。得到的视网膜类器官同人类正常视网膜的神经细胞组成一致，且发育的时间和空间顺序接近于正常的人类视网膜。该细胞系是一种强大的工具，可帮助实现人类视网膜发育和疾病产生的相关研究，并促进致盲疾病治疗方法的开发。

简介：摘要目的观察新型光敏蛋白PsCatCh2.0转染至视网膜色素变性模型rd1小鼠视网膜1年后视网膜神经节细胞（RGC）对光反应、视网膜炎症及细胞凋亡情况。方法雄性rd1小鼠24只随机均分为rd1实验组、rd1对照组，各12只。rd1实验组小鼠鼻侧角巩膜缘下1 mm处玻璃体腔注射重组腺相关病毒（rAAV）2/2-巨细胞病毒启动子（CMV）-PsCatCh2.0-增强型绿色荧光蛋白（EGFP）1.5 μl，2周后颞侧角巩膜缘下1 mm处再次注射相同剂量的重组病毒。注射后1年，用膜片钳技术记录表达PsCatCh2.0的RGC对光反应；行免疫荧光染色评估PsCatCh2.0在视网膜中的表达情况；行视网膜铺片染色评估重组病毒的转染效率，并计数RGC；使用苏木精-伊红染色评估内层视网膜厚度；采用蛋白免疫印迹法检测视网膜中核因子（NF）-κB p65的蛋白表达；采用实时荧光定量聚合酶链反应检测各组小鼠视网膜中肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-6、B淋巴细胞瘤-2相关X蛋白（Bax）mRNA相对表达量；采用原位末端标记法观察各组小鼠视网膜细胞凋亡情况。组间比较采用单因素方差分析。结果注射重组病毒后1年，表达PsCatCh2.0的RGC产生的电流约为30 pA。PsCatCh2.0-EGFP与RGC呈共定位表达；少量与无长突细胞共定位，几乎不与水平细胞、双极细胞共定位。rd1实验组、rd1对照组小鼠RGC密度、内层视网膜厚度比较，差异均无统计学意义（F=14.35、0.05，P>0.05）。rd1实验组小鼠视网膜NF-κB p65蛋白表达量以及TNF-α、IL-6 mRNA表达均低于rd1对照组，差异均有统计学意义（F=4.61、5.91、5.78，P<0.05）。rd1实验组小鼠视网膜中呈红色荧光的凋亡细胞数量少于rd1对照组，Bax mRNA表达低于rd1对照组，差异有统计学意义（F=7.52，P<0.01 ）。结论玻璃体腔注射rAAV2/2-CMV-PsCatCh2.0-EGFP后1年，表达PsCatCh2.0的RGC仍可产生光电流；长期转染表达PsCatCh2.0对RGC无明显细胞毒性作用，也不增加视网膜的炎性反应。

简介：摘要目的观察并分析象限性视网膜色素变性（sector RP）的致病基因及临床表型。方法回顾性临床研究。2021年4月于武汉大学人民医院眼科就诊的sector RP一家系的1例患者（先证者）及其父母纳入研究。详细询问病史并行最佳矫正视力（BCVA）、眼底彩色照相、自身荧光（AF）、视野、光相干断层扫描（OCT）、视网膜电图（ERG）、荧光素眼底血管造影（FFA）、吲哚青绿血管造影（ICGA）检查。采集先证者及其父母的外周静脉血3 ml，提取全基因组DNA。全外显子测序，采用Sanger测序及实时定量聚合酶链反应对变异位点进行验证，并进行生物信息学分析和共分离分析。结果先证者男，17岁。双眼视力渐进性下降2年。双眼BCVA均为0.4；视网膜血管变细，黄斑区营养不良，无明显色素沉着；眼底AF检查，鼻下象限视网膜变性呈斑驳影，黄斑呈"花瓣状"强AF；视野检查，双眼对称性颞上方视野缺失；OCT检查，中心凹区域以外光感受器层消失；ERG检查，暗适应波幅降低、明适应呈熄灭状态；FFA和ICGA检查，视盘周围及下方视网膜色素上皮层萎缩。其父母眼部表型正常。基因检测结果显示，先证者SPATA7基因第10号外显子存在一错义突变c.1112T>C（p.Ile371Thr），导致编码的SPATA7蛋白第371号氨基酸由异亮氨酸变成苏氨酸；其母亲携带c.1112T>C杂合突变。根据美国医学遗传学和基因组学学院（ACMG）遗传变异分类标准与指南，该变异为意义不明确变异。同源染色体存在一来源于父亲的拷贝数变异，导致SPATA7基因第10号外显子缺失。根据ACMG指南，该变异为可能致病变异。结论sector RP可累及黄斑，导致黄斑营养不良；SPATA7基因c.1112T>C（p.Ile371Thr）错义突变可能是本家系的致病原因。