简介：摘要目的探讨三维生物打印负载纳米银的甲基丙烯酸酐化明胶（GelMA）水凝胶对大鼠全层皮肤缺损创面的作用。方法采用实验研究方法。采用扫描电子显微镜观察不同质量浓度的纳米银溶液中的纳米银颗粒的形态、粒径、分布和含不同终质量分数GelMA的含银GelMA水凝胶的孔隙结构，并计算孔径大小。处理1、3、7、14 d，采用质谱仪检测含终质量分数15% GelMA和终质量浓度10 mg/L纳米银的水凝胶的纳米银释放浓度。培养24 h，检测含终质量浓度0（无纳米银）、25、50、100 mg/L纳米银的GelMA水凝胶对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的抑菌圈直径。取浙江大学医学院附属第二医院泌尿外科2020年7月收治的1名健康5岁男童包皮环切术后废弃包皮和该院整形外科2020年7月收治的1名健康23岁女性抽脂手术后废弃脂肪，采用酶解法分别提取成纤维细胞（Fb）和脂肪干细胞（ASC）。将Fb分为仅有培养基的空白对照组和另加入含相应终质量浓度纳米银溶液的2 mg/L纳米银组、5 mg/L纳米银组、10 mg/L纳米银组、25 mg/L纳米银组、50 mg/L纳米银组，培养48 h，采用细胞计数试剂盒8检测Fb增殖活性。将Fb分为进行相应处理的0 mg/L含银GelMA水凝胶组、10 mg/L含银GelMA水凝胶组、50 mg/L含银GelMA水凝胶组、100 mg/L含银GelMA水凝胶组，于培养1、3、7 d，同前检测Fb增殖活性。将ASC与GelMA水凝胶混合种植，分为三维生物打印组和非打印组，于培养1、3、7 d，同前检测ASC增殖活性并行活/死细胞荧光染色观察ASC生长情况。以上实验中样本数均为3。于18只雄性4~6周龄SD大鼠背部各制作4个全层皮肤缺损创面，分别设为单纯水凝胶组、水凝胶/纳米银组、水凝胶支架/纳米银组、水凝胶支架/纳米银/ASC组并移植相应支架。分别于伤后4、7、14、21 d，行大体观察并计算创面愈合率（样本数为6）；于伤后7、14 d，对创面行苏木精-伊红染色观察组织病理学改变（样本数为6）；于伤后21 d，对创面行Masson染色观察胶原排列情况（样本数为3）。对数据行单因素方差分析、重复测量方差分析、Bonferroni校正、独立样本t检验。结果不同质量浓度的纳米银溶液中的纳米银颗粒均呈圆形，散在分布，粒径均匀。含不同终质量分数GelMA的含银GelMA水凝胶都呈现大小不一且相互连通的孔隙结构。含终质量分数10% GelMA的含银GelMA水凝胶的孔径明显大于含终质量分数15%和20% GelMA的含银GelMA水凝胶（P值均<0.05）。处理1、3、7 d，含银GelMA水凝胶的体外纳米银释放浓度的变化趋势相对平缓；处理14 d，其体外纳米银释放浓度迅速增加。培养24 h，含0、25、50、100 mg/L纳米银的GelMA水凝胶对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的抑菌圈直径分别为0、0、0.7、2.1 mm和0、1.4、3.2、3.3 mm。培养48 h，2 mg/L纳米银组、5 mg/L纳米银组Fb的增殖活性均明显高于空白对照组（P<0.05），10 mg/L纳米银组、25 mg/L纳米银组、50 mg/L纳米银组Fb的增殖活性均明显低于空白对照组（P<0.05）。与0 mg/L含银GelMA水凝胶组相比，培养1 d，50 mg/L含银GelMA水凝胶组、100 mg/L含银GelMA水凝胶组Fb的增殖活性均明显降低（P<0.05）；培养3 d，50 mg/L含银GelMA水凝胶组Fb的增殖活性明显升高（P<0.05），100 mg/L含银GelMA水凝胶组Fb的增殖活性明显降低（P<0.05）；培养7 d，100 mg/L含银GelMA水凝胶组Fb的增殖活性明显降低（P<0.05）。培养1 d，三维生物打印组的ASC增殖活性与非打印组比较，差异无统计学意义（P>0.05）；培养3、7 d，三维生物打印组的ASC增殖活性均明显高于非打印组（t值分别为21.50、12.95，P<0.05）。培养1 d，三维生物打印组死亡ASC数略多于非打印组。培养3、5 d，三维生物打印组和非打印组中的绝大多数ASC为活细胞。伤后4 d，单纯水凝胶组和水凝胶/纳米银组大鼠创面渗液较多，水凝胶支架/纳米银组和水凝胶支架/纳米银/ASC组大鼠创面干燥且未见明显感染迹象。伤后7 d，单纯水凝胶组和水凝胶/纳米银组大鼠创面仍有少量渗液，水凝胶支架/纳米银组和水凝胶支架/纳米银/ASC组大鼠创面干燥结痂。伤后14 d，4组大鼠创面上的水凝胶均脱落。伤后21 d，仅单纯水凝胶组仍有少量创面未愈合。伤后4、7 d，水凝胶支架/纳米银/ASC组大鼠创面愈合率均明显高于其他3组（P<0.05）。伤后14 d，水凝胶支架/纳米银/ASC组大鼠创面愈合率明显高于水凝胶/纳米银组和单纯水凝胶组（P值均<0.05）。伤后21 d，单纯水凝胶组大鼠创面愈合率明显低于水凝胶支架/纳米银/ASC组（P<0.05）。伤后7 d，4组大鼠创面上的水凝胶均保持在位；伤后14 d，单纯水凝胶组大鼠的水凝胶已与创面脱离，而其余3组仍有部分水凝胶存在于创面新生组织中。伤后21 d，单纯水凝胶组大鼠创面胶原排列无序，而水凝胶/纳米银组、水凝胶支架/纳米银组、水凝胶支架/纳米银/ASC组大鼠创面胶原排列相对有序。结论含银GelMA水凝胶具有良好的生物相容性及抗菌性能，其三维生物打印的双层结构能更好地与大鼠全层皮肤缺损创面新生组织相融合并促进创面愈合。