简介:摘要口腔软组织工程涉及口腔颌面功能和美学的修复重建。三维生物打印作为21世纪初的新兴技术,包裹细胞的生物墨水可通过模拟发育过程中组织的自组装促进再生,在组织工程中的应用前景巨大。口腔软组织既包括口腔特有的牙髓、牙周膜、牙龈、口腔黏膜和唾液腺,也包括颌面部涉及的皮肤、血管、肌肉和神经等组织。目前,三维生物打印在口腔特有软组织修复中主要应用于牙髓再生领域,利用不同的生物墨水荷载牙髓细胞在牙本质基质中修复牙髓组织;三维生物打印在牙周膜重建和类唾液腺培养方面仅有少量体外研究;且尚未检索到三维生物打印在牙龈和口腔黏膜再生方面的应用。这应与牙周膜复杂精细有序结构、口腔的湿润环境、有限的操作空间以及持续的咀嚼压力相关。对于皮肤、血管、肌肉和神经的三维生物打印,虽研究较多,但大多无口腔针对性。本文简要介绍目前以细胞相容水凝胶为生物墨水的三维生物打印在口腔软组织再生中的应用现状及前景展望。
简介:摘要目的探讨三维生物打印负载纳米银的甲基丙烯酸酐化明胶(GelMA)水凝胶对大鼠全层皮肤缺损创面的作用。方法采用实验研究方法。采用扫描电子显微镜观察不同质量浓度的纳米银溶液中的纳米银颗粒的形态、粒径、分布和含不同终质量分数GelMA的含银GelMA水凝胶的孔隙结构,并计算孔径大小。处理1、3、7、14 d,采用质谱仪检测含终质量分数15% GelMA和终质量浓度10 mg/L纳米银的水凝胶的纳米银释放浓度。培养24 h,检测含终质量浓度0(无纳米银)、25、50、100 mg/L纳米银的GelMA水凝胶对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的抑菌圈直径。取浙江大学医学院附属第二医院泌尿外科2020年7月收治的1名健康5岁男童包皮环切术后废弃包皮和该院整形外科2020年7月收治的1名健康23岁女性抽脂手术后废弃脂肪,采用酶解法分别提取成纤维细胞(Fb)和脂肪干细胞(ASC)。将Fb分为仅有培养基的空白对照组和另加入含相应终质量浓度纳米银溶液的2 mg/L纳米银组、5 mg/L纳米银组、10 mg/L纳米银组、25 mg/L纳米银组、50 mg/L纳米银组,培养48 h,采用细胞计数试剂盒8检测Fb增殖活性。将Fb分为进行相应处理的0 mg/L含银GelMA水凝胶组、10 mg/L含银GelMA水凝胶组、50 mg/L含银GelMA水凝胶组、100 mg/L含银GelMA水凝胶组,于培养1、3、7 d,同前检测Fb增殖活性。将ASC与GelMA水凝胶混合种植,分为三维生物打印组和非打印组,于培养1、3、7 d,同前检测ASC增殖活性并行活/死细胞荧光染色观察ASC生长情况。以上实验中样本数均为3。于18只雄性4~6周龄SD大鼠背部各制作4个全层皮肤缺损创面,分别设为单纯水凝胶组、水凝胶/纳米银组、水凝胶支架/纳米银组、水凝胶支架/纳米银/ASC组并移植相应支架。分别于伤后4、7、14、21 d,行大体观察并计算创面愈合率(样本数为6);于伤后7、14 d,对创面行苏木精-伊红染色观察组织病理学改变(样本数为6);于伤后21 d,对创面行Masson染色观察胶原排列情况(样本数为3)。对数据行单因素方差分析、重复测量方差分析、Bonferroni校正、独立样本t检验。结果不同质量浓度的纳米银溶液中的纳米银颗粒均呈圆形,散在分布,粒径均匀。含不同终质量分数GelMA的含银GelMA水凝胶都呈现大小不一且相互连通的孔隙结构。含终质量分数10% GelMA的含银GelMA水凝胶的孔径明显大于含终质量分数15%和20% GelMA的含银GelMA水凝胶(P值均<0.05)。处理1、3、7 d,含银GelMA水凝胶的体外纳米银释放浓度的变化趋势相对平缓;处理14 d,其体外纳米银释放浓度迅速增加。培养24 h,含0、25、50、100 mg/L纳米银的GelMA水凝胶对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的抑菌圈直径分别为0、0、0.7、2.1 mm和0、1.4、3.2、3.3 mm。培养48 h,2 mg/L纳米银组、5 mg/L纳米银组Fb的增殖活性均明显高于空白对照组(P<0.05),10 mg/L纳米银组、25 mg/L纳米银组、50 mg/L纳米银组Fb的增殖活性均明显低于空白对照组(P<0.05)。与0 mg/L含银GelMA水凝胶组相比,培养1 d,50 mg/L含银GelMA水凝胶组、100 mg/L含银GelMA水凝胶组Fb的增殖活性均明显降低(P<0.05);培养3 d,50 mg/L含银GelMA水凝胶组Fb的增殖活性明显升高(P<0.05),100 mg/L含银GelMA水凝胶组Fb的增殖活性明显降低(P<0.05);培养7 d,100 mg/L含银GelMA水凝胶组Fb的增殖活性明显降低(P<0.05)。培养1 d,三维生物打印组的ASC增殖活性与非打印组比较,差异无统计学意义(P>0.05);培养3、7 d,三维生物打印组的ASC增殖活性均明显高于非打印组(t值分别为21.50、12.95,P<0.05)。培养1 d,三维生物打印组死亡ASC数略多于非打印组。培养3、5 d,三维生物打印组和非打印组中的绝大多数ASC为活细胞。伤后4 d,单纯水凝胶组和水凝胶/纳米银组大鼠创面渗液较多,水凝胶支架/纳米银组和水凝胶支架/纳米银/ASC组大鼠创面干燥且未见明显感染迹象。伤后7 d,单纯水凝胶组和水凝胶/纳米银组大鼠创面仍有少量渗液,水凝胶支架/纳米银组和水凝胶支架/纳米银/ASC组大鼠创面干燥结痂。伤后14 d,4组大鼠创面上的水凝胶均脱落。伤后21 d,仅单纯水凝胶组仍有少量创面未愈合。伤后4、7 d,水凝胶支架/纳米银/ASC组大鼠创面愈合率均明显高于其他3组(P<0.05)。伤后14 d,水凝胶支架/纳米银/ASC组大鼠创面愈合率明显高于水凝胶/纳米银组和单纯水凝胶组(P值均<0.05)。伤后21 d,单纯水凝胶组大鼠创面愈合率明显低于水凝胶支架/纳米银/ASC组(P<0.05)。伤后7 d,4组大鼠创面上的水凝胶均保持在位;伤后14 d,单纯水凝胶组大鼠的水凝胶已与创面脱离,而其余3组仍有部分水凝胶存在于创面新生组织中。伤后21 d,单纯水凝胶组大鼠创面胶原排列无序,而水凝胶/纳米银组、水凝胶支架/纳米银组、水凝胶支架/纳米银/ASC组大鼠创面胶原排列相对有序。结论含银GelMA水凝胶具有良好的生物相容性及抗菌性能,其三维生物打印的双层结构能更好地与大鼠全层皮肤缺损创面新生组织相融合并促进创面愈合。
简介:摘要目的探讨人脂肪来源蛋白复合物(ADPC)对人皮肤成纤维细胞(HSF)和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖和迁移能力的影响,以及含ADPC的三维生物打印墨水(Bioink)在裸鼠全层皮肤缺损创面中的修复效应。方法采用实验研究方法。收集解放军总医院2020年10月—2021年3月收治的3例行腹部皮瓣转移修补术的女性慢性创面患者(年龄29~34岁)的废弃皮下脂肪组织和同期收治的3名行腹部抽脂术的健康女性(年龄24~36岁)的废弃抽脂术脂肪组织,分别制备正常ADPC(nADPC)及抽脂术ADPC(lADPC)。采用二辛丁酸法测定2种ADPC的蛋白浓度,计算2种ADPC的提取效率,样本数均为3。取对数生长期HSF和HUVEC进行后续实验。取2种细胞均按随机数字表法(分组方法下同)分为磷酸盐缓冲液(PBS)对照组、4 μg/mL nADPC组、20 μg/mL nADPC组、100 μg/mL nADPC组和200 μg/mL nADPC组,每组5孔。PBS对照组细胞采用PBS培养,余4组分别采用含相应终质量浓度的nADPC培养。常规培养24 h,采用细胞计数试剂盒8法检测细胞增殖活力。取HSF和HUVEC,分为PBS对照组、单纯nADPC组、单纯lADPC组、单纯肿瘤坏死因子α(TNF-α)组、TNF-α+nADPC组、TNF-α+lADPC组。PBS对照组与单纯TNF-α组细胞分别加入PBS,单纯nADPC组、单纯lADPC组、TNF-α+nADPC组及TNF-α+lADPC组中分别加入终质量浓度100 μg/mL的nADPC或lADPC,单纯TNF-α组、TNF-α+nADPC组及TNF-α+lADPC组再加入终质量浓度20 ng/mL的TNF-α。进行细胞划痕试验后计算划痕后24 h细胞迁移率(样本数为3),同前检测培养24 h细胞增殖活力(样本数为5)。取明胶-海藻酸钠复合Bioink(Bioink AG),制备含100 μg/mL lADPC的Bioink AG(lADPC-Bioink AG),观察二者在室温下及冷凝后的形态和三维生物打印且交联后的形态,采用流变仪检测流变性能时记录低温成胶时间(样本数为3)。取20只8~10周龄雌性BALB/c-NU裸鼠,建立背部全层皮肤缺损创面模型后,分为常规换药组、单纯lADPC组、单纯Bioink AG组和lADPC-Bioink AG组,每组5只。常规换药组裸鼠创面仅覆盖水胶体敷料和常规换药,其余3组裸鼠创面另予相应lADPC、Bioink AG、lADPC-Bioink AG处理。从治疗0 d起,行大体观察,计算治疗2、6、10 d的创面愈合率。治疗10 d,采用苏木精-伊红染色行创面组织病理学观察。对数据行独立样本t检验、单因素方差分析、重复测量方差分析、SNK-q检验及LSD-t检验。结果lADPC的蛋白浓度、提取效率分别为(1.306±0.011)mg/mL、(11.1±1.5)%,明显低于nADPC的(2.039±0.042)mg/mL、(22.2±2.0)%(t=23.83、6.38,P<0.05或P<0.01)。培养24 h,与PBS对照组比较,100 μg/mL nADPC组和200 μg/mL nADPC组HSF(q=6.943、6.375,P<0.01)和HUVEC(q=6.301、6.496,P<0.01)增殖活力均明显下降;与100 μg/mL nADPC组比较,200 μg/mL nADPC组HSF和HUVEC增殖活力无明显变化(P>0.05)。划痕后24 h,与PBS对照组比较,单纯nADPC组、单纯lADPC组、单纯TNF-α组HSF和HUVEC迁移率均明显降低(q=5.642、6.645、11.480,4.772、6.298、10.420,P<0.05或P<0.01);与单纯nADPC组比较,单纯lADPC组HSF和HUVEC迁移率无明显变化(P>0.05);与单纯TNF-α组比较,TNF-α+nADPC组、TNF-α+lADPC组HSF迁移率无明显变化(P>0.05),HUVEC迁移率均明显升高(q=8.585、7.253,P<0.01);与TNF-α+nADPC组比较,TNF-α+lADPC组HSF和HUVEC迁移率无明显变化(P>0.05)。培养24 h,与PBS对照组比较,单纯nADPC组、单纯lADPC组、单纯TNF-α组HSF和HUVEC增殖活力均明显降低(q=5.803、5.371、9.136,11.580、9.493、13.510,P<0.05或P<0.01);与单纯nADPC组比较,单纯lADPC组HSF和HUVEC增殖活力均无明显变化(P>0.05);与单纯TNF-α组比较,TNF-α+nADPC组、TNF-α+lADPC组HSF(q=14.990、10.850,P<0.01)和HUVEC(q=7.066、8.942,P<0.01)增殖活力均明显升高;与TNF-α+nADPC组比较,TNF-α+lADPC组HSF和HUVEC增殖活力均无明显变化(P>0.05)。室温及冷凝状态下,lADPC-Bioink AG比Bioink AG外观稍显浑浊;三维生物打印且交联后lADPC-Bioink AG与Bioink AG形态类似。在10 ℃时,lADPC-Bioink AG的凝固时间为(76.6±0.4)s,明显慢于Bioink AG的(74.4±0.6)s(t=4.64,P<0.01)。治疗2 d,常规换药组裸鼠创面渗出较多,其余3组无明显渗出;治疗8 d,lADPC-Bioink AG组裸鼠残余创面面积最小,有明显上皮覆盖。治疗2 d,lADPC-Bioink AG组裸鼠创面愈合率明显高于单纯lADPC组(t=3.59,P<0.05),与常规换药组、单纯Bioink AG组相近(P>0.05);治疗6 d,lADPC-Bioink AG组裸鼠创面愈合率明显高于常规换药组、单纯lADPC组、单纯Bioink AG组(t=18.70、15.70、3.15,P<0.05或P<0.01);治疗10 d,lADPC-Bioink AG组裸鼠创面愈合率明显高于常规换药组、单纯lADPC组(t=12.51、4.84,P<0.01),与单纯Bioink AG组相近(P>0.05)。治疗10 d,lADPC-Bioink AG组裸鼠创面组织血管化程度适中,上皮化充分,愈合效果最好。结论抽脂术相关操作会降低ADPC蛋白浓度、提取效率等表征,但lADPC与nADPC具有相同的生物学作用,可在非炎症环境中抑制HSF与HUVEC的增殖与迁移能力,在炎症环境中提高HSF与HUVEC的增殖活力,同时提高HUVEC的迁移能力;将lADPC加入Bioink AG中后,不会明显影响Bioink AG的物理性质及打印性能,并可以提升裸鼠全层皮肤缺损创面的修复效果。
简介:摘要目的探讨含人脐血来源富血小板血浆(HUCB-PRP)的海藻酸钠-明胶(AG)生物墨水(称为HUCB-PRP-AG生物墨水)的可打印性能和细胞相容性,及该生物墨水的三维打印组织治疗裸鼠全层皮肤缺损创面的效果。方法采用实验研究方法。制备含体积分数2.5%、5.0%、10.0%HUCB-PRP的HUCB-PRP-AG生物墨水,分别命名为1P-AG、2P-AG、4P-AG。取AG、1P-AG、2P-AG、4P-AG,观察室温下外观,采用旋转流变仪检测黏度、储能模量和损耗模量。利用以上4种生物墨水分别进行三维生物打印并观察打印组织外观(后续使用交联后打印组织),将4种打印组织分别与人脐静脉内皮细胞(HUVEC)在Transwell小室内用HUVEC专用培养基共培养24 h,采用细胞计数试剂盒8检测细胞增殖水平(样本数为3);将4种打印组织分别用DMEM培养基培养12、24、48 h,进行干燥称重并计算降解率(样本数为3);将1P-AG、2P-AG、4P-AG打印组织分别用磷酸盐缓冲液培养0.5、24.0、48.0 h,采用酶联免疫吸附测定法检测培养上清液中血管内皮生长因子(VEGF)的表达(样本数为5)。取16只6~8周龄雌性BALB/c-NU裸鼠建立背部全层皮肤缺损创面模型,分为创面仅覆盖医用水胶体敷料的常规对照组和另予HUCB-PRP滴加的HUCB-PRP组、AG打印组织覆盖的AG组、4P-AG打印组织覆盖的4P-AG组(每组4只),观察每组3只裸鼠伤后4、8、14 d创面愈合情况并计算创面愈合率;取每组剩余裸鼠伤后8 d创面组织,行苏木精-伊红染色后观察组织病理学改变,行免疫组织化学染色后观察CD31阳性新生血管情况。对数据行重复测量方差分析、LSD检验及Bonferroni校正。结果在室温下,AG、1P-AG、2P-AG、4P-AG均呈半透明液态;AG为淡黄色,1P-AG、2P-AG、4P-AG均为淡红色但颜色依次逐渐加深。在温度10 ℃和剪切率0.1~10.0 s-1范围内,AG、1P-AG、2P-AG、4P-AG的黏度均随着剪切率的增加而减小;在温度10 ℃和角频率1~100 rad/s范围内,4种生物墨水的储能模量均大于损耗模量。4种生物墨水打印组织的分辨率与形态均相近。与1P-AG、2P-AG、4P-AG打印组织共培养24 h的HUVEC增殖水平分别为0.885±0.030、1.126±0.032、1.156±0.045,均明显高于与AG打印组织共培养的HUVEC的0.712±0.019(P<0.01);与2P-AG、4P-AG打印组织共培养24 h的HUVEC增殖水平均明显高于与1P-AG打印组织共培养的HUVEC(P<0.01)。1P-AG、2P-AG、4P-AG打印组织培养12、24、48 h的降解率均明显高于AG打印组织(P<0.01);2P-AG、4P-AG打印组织培养24、48 h的降解率均明显高于1P-AG打印组织(P<0.01);4P-AG打印组织培养12 h的降解率明显高于1P-AG打印组织(P<0.01),培养24、48 h的降解率均明显高于2P-AG打印组织(P<0.01)。培养0.5、24.0、48.0 h,2P-AG打印组织培养上清液中VEGF表达量均明显高于1P-AG打印组织(P<0.01),1P-AG和2P-AG打印组织培养上清液中VEGF表达量均明显低于4P-AG打印组织(P<0.01)。常规对照组与HUCB-PRP组裸鼠伤后8 d创面较伤后4 d干燥且缩小,HUCB-PRP组裸鼠伤后14 d创面较常规对照组缩小且无结痂;AG组、4P-AG组裸鼠伤后4 d创面上打印组织明显降解且创面无明显渗出,伤后8 d创面明显上皮化且缩小,伤后14 d创面无结痂;4P-AG组裸鼠伤后14 d创面完全上皮化。与常规对照组比较,AG组裸鼠伤后4 d创面愈合率明显降低(P<0.05),HUCB-PRP组、4P-AG组裸鼠伤后各时间点及AG组裸鼠伤后8、14 d创面愈合率均明显升高(P<0.01);与HUCB-PRP组比较,AG组裸鼠伤后4、8 d及4P-AG组裸鼠伤后4 d创面愈合率均明显降低(P<0.01),AG组裸鼠伤后14 d及4P-AG组裸鼠伤后8、14 d创面愈合率均明显升高(P<0.01);4P-AG组裸鼠伤后各时间点创面愈合率均明显高于AG组(P<0.01)。伤后8 d,常规对照组裸鼠创面组织可见大量炎症细胞浸润、少量新生微血管以及少量CD31阳性新生血管,HUCB-PRP组裸鼠创面组织可见大量炎症细胞浸润、丰富新生微血管以及较多CD31阳性新生血管,AG组裸鼠创面组织可见轻度炎症浸润、少量新生微血管以及少量CD31阳性新生血管,4P-AG组裸鼠创面组织可见轻度炎症浸润、大量新生微血管以及大量CD31阳性新生血管。结论HUCB-PRP-AG生物墨水具备良好的可打印性能和细胞相容性,其三维打印组织可促进裸鼠全层皮肤缺损创面血管化,加速创面愈合。
简介:背景:构建三维的预血管化系统,对于大尺寸、复杂三维结构组织内细胞的存活和功能表达均具有决定性作用。因此,寻找一种合适的预血管化策略已成为3D生物打印大尺寸、复杂三维组织亟待解决的问题。目的:对3D生物打印大尺寸、预血管化三维结构进行初步的探索。方法:用逆向工程软件Catia设计三维生物打印蓝图;以改装后的桌面级双喷头3D打印机为生物打印机,以聚乙烯醇为牺牲材料打印牺牲骨架;以大鼠骨髓间充质干细胞、海藻酸钠、琼脂糖和纳米纤维素溶液的混合物为细胞生物墨水。根据预先设计的参数进行生物打印,构建具有三维流体通道的组织工程三维结构体。观察打印获得的三维结构体,评价打印后及材料溶解后的细胞活性;体外培养打印获得的结构体,并用AlamarBlue试剂盒检测细胞在三维结构体中的增殖。结果与结论:利用Catia软件设计出了具有微孔的外壁及内部纵横交错的微管结构的双喷头打印模型,用该三维生物打印技术构建出具有自定义尺寸(尤其是高度)和预血管化的三维结构,结构体中细胞12h的存活率为(95.47±0.54)%,随着体外培养时间的延长,细胞存活率下降并稳定在80%以上。随着培养时间的增加,构建体中的细胞增殖呈上升趋势。结果表明:该生物打印方法可用于通过使用各种生物水凝胶材料制造不同特性的三维结构体,在生物制造具有临床相关尺寸的预血管化的复杂组织器官方面具有潜力。
简介:摘要近年来,随着我国铁路工程建设的高速发展,在一些新建铁路建设工程中不可避免的对建设地域的自然环境造成了较大的影响,尤其是其中的土石方开挖及路基填筑工程,导致了线路两侧大量的边坡裸露问题,既对当地原有的自然环境造成了破坏,还对过往的人员行车安全造成一定的威胁。因此,铁路建设需要考虑如何在不影响自身交通运行功能的情况下还能保证当地的生态环境免遭破坏。传统的边坡防护技术,很难在起到加固防护作用,同时还无法避免大风扬尘等环境污染,实际工程中更需要一些兼具很强的实用性和生态环保功能的新技术,而三维生态护坡防护技术则正是其中的佼佼者。