简介：摘要目的建立红色荧光蛋白mCherry在衣原体中稳定表达的方法，并使用荧光菌株Cm-mCherry构建有效的衣原体感染模型。方法构建含有红色荧光蛋白mCherry的重组质粒pmCherry：：CM，利用氯化钙法将pmCherry：：CM转化至衣原体质粒缺失株CMUT中，经过筛选与纯化得到荧光菌株Cm-mCherry。Cm-mCherry感染HeLa229细胞后观察包涵体中红色荧光的发光情况，并与间接免疫荧光染色法比较，评估细胞感染模型构建是否成功；Cm-mCherry感染小鼠后，通过测定下生殖道载菌量、冷冻切片观察上生殖道衣原体红色荧光、分离生殖道评价输卵管积水发病情况，确定Cm-mCherry的感染力、侵袭力与致病性，评估动物感染模型构建是否成功。结果红色荧光蛋白mCherry在转化株Cm-mCherry中稳定表达，红色荧光蛋白标记法与间接免疫荧光染色法一致度高；Cm-mCherry小鼠感染模型中，感染率为100%(10/10)，下生殖道载菌量可稳定保持高水平，在上生殖道冷冻切片中可观察到带有红色荧光的包涵体，输卵管积水发病程度与Cm野生株差异无统计学意义(P>0.05)，证实Cm-mCherry有较好的感染力、侵袭力与致病性。结论成功建立红色荧光蛋白mCherry在衣原体中稳定表达的方法，转化后的荧光菌株Cm-mCherry有较好的感染力、侵袭力与致病性，可用于衣原体细胞、动物感染模型的构建，为研究衣原体感染机制提供良好的实验工具。

简介：将绿色荧光蛋白（GFP）基因导入家蚕蛹（G0）的睾丸,利用荧光显微镜技术检测到绿色荧光蛋白基因在家蚕卵（G1）表达的荧光图像。

简介：来自水母的绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein，GFP）具有很多理想的特性，被喻为活分子探针。GFP适用于作普遍的报告标记，尤其适用于活体细胞或组织，已被广泛应用于动物学、植物学、微生物学等领域的研究。本文对GFP在药学研究中的应用做一综述。

简介：目的建立绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein，GFP）转基因小鼠肝癌模型，观察GFP蛋白在诱癌过程中荧光的变化。方法采用二乙基亚硝胺（diethylnitrosamine，DENA）／四氯化碳（CCk，乙醇／DENA诱导肝癌共20周，实验组50只和对照组10只均为GFP转基因小鼠。每周监测小鼠体重的变化；常规HE染色动态观察病理组织学；第4、12、16周处死小鼠取肝组织制作冷冻切片观察荧光表达，并以石蜡HE染色观察病理变化；第20周时处死小鼠取其肝肿物进行原代培养，观察肿瘤细胞中荧光表达和分布。结果实验组GFP转基因小鼠死亡15只，死亡率30％（15／50）。对照组10只小鼠未发生死亡。GFP转基因小鼠在诱癌的第4、12、16、20周依次出现肝炎，肝硬化、癌前病变和癌变等。荧光显微镜下观察到诱癌开始前、第4周、第12周和第16周肝脏组织的冷冻切片有GFP蛋白的表达，诱癌第20周肝肿物原代培养中肿瘤细胞的细胞质和细胞核中有GFP蛋白表达。结论本实验成功建立GFP转基因小鼠肝癌发生的动物模型，可动态观察肝癌细胞中GFP蛋白的表达。

简介：2008年10月8日（北京时间），瑞典皇家科学院诺贝尔奖委员会宣布，授予美国WoodsHole海洋生物学实验室的下村修（OsamuShimomura）、哥伦比亚大学的马丁·沙尔菲（MartinChalfie）和加州大学圣地亚哥分校的钱永健（RogerY．Tsien）三位科学家2008年度诺贝尔化学奖，以表彰三人在绿色荧光蛋白（GPF）发现、表达和应用方面做出的突出贡献。

简介：摘要目的探讨绿色荧光蛋白作为标记蛋白其荧光强度与胰岛素表达量的相关性。方法构建重组质粒prIns1EGFP，转染HIT-T15仓鼠胰岛瘤细胞，随机分为3组，低糖组（LG）、中糖组（MG），高糖组（HG）,检测基线0小时及葡萄糖刺激后4小时内胰岛素分泌量及单个胰岛β细胞荧光强度。结果HG组单个胰岛β细胞荧光强度，胰岛素分泌量较LG组明显增强（P＜0.05），在一定葡萄糖浓度范围内，绿色荧光蛋白其荧光强度随着葡萄糖浓度的升高而升高，并与细胞胰岛素分泌量呈明显的正相关，相关系数R为0.896。（P＜0.05）结论绿色荧光蛋白作为分子标记物其荧光强度与胰岛素分泌量有正相关性。

简介：目的：通过多点突变构建增强型青色荧光蛋白（ECFP）慢病毒表达载体。方法与结果：根据增强型绿色荧光蛋白（EGFP）和ECFP基因序列的差异设计3对引物,以pLentiLox3.7-EGFP为模板进行分段PCR扩增,再以分段PCR扩增产物为模板扩增出突变的ECFP基因片段,将其与载体连接,得到ECFP慢病毒表达载体pLentiLox3.7-ECFP,测序结果证实经过多点突变扩增的ECFP片段基因序列完全正确;磷酸钙介导pLentiLox3.7-ECFP在293T细胞中表达,48h后在荧光显微镜下观察到青色荧光蛋白。结论：通过多点突变的方法得到了ECFP慢病毒表达载体。

简介：背景：对牙髓干细胞进行稳定高效安全的体外标记是示踪技术中首先需要解决的问题，也是牙齿再生体内研究的基础。目的：探讨慢病毒载体介导绿色荧光蛋白转染大鼠牙髓干细胞的理想条件及方法，并确定其转染后是否保持干细胞特性。方法：通过改良酶消化法获得大鼠牙髓干细胞，对其免疫表型及分化潜能进行鉴定，以感染复数为5，10，25，50和100的慢病毒载体介导绿色荧光蛋白作用24h和48h，倒置显微镜下检测转染率和荧光强度，并对大鼠牙髓干细胞感染前后的克隆增殖能力、细胞周期及牙向分化能力进行比较，评价感染对其生物学特性的影响。结果与结论：流式细胞仪检测结果显示大鼠牙髓干细胞STRO-1和CD146表达阳性，CD34和CD45表达阴性，经相应诱导培养后可向成骨和成脂分化。当感染复数为50，作用时间为48h时，转染效率最高，荧光表达最强；感染前后细胞增殖、克隆形成率及细胞周期等方面差异无显著性意义（P＞0.05），碱性磷酸酶阳性表达。说明感染复数为50作用48h是慢病毒载体介导绿色荧光蛋白转染大鼠牙髓干细胞的理想条件，且不影响牙髓干细胞生物学特性，为大鼠牙髓干细胞的体内研究提供了可靠的示踪方法。

简介：荧光示踪技术是激发光通过激发荧光基团到达高能量状态，而后产生发射光，并利用生物荧光影像分析技术直接检测活体生物体内的细胞活动和基因行为。最常用的是绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein，GFP），随后发现的红色荧光蛋白（redfluorescentprotein，RFP）在灵敏度和信噪比方面均比GFP高，此外还有黄色荧光蛋白（yellowfluorescentprotein，YFP）等，这为基于GFP的体内研究提供了一个很好的互补工具。随着荧光蛋白在细胞生物学上的广泛应用，使活体细胞显像问题得以解决，并且获得了空前的发展。尤其是荧光蛋白可以对各种细胞过程进行显像示踪，这些蛋白可作为报告基因，独特的荧光光谱能在体内外对尚未明确的细胞过程进行示踪。比如肿瘤发生发展过程中的各个阶段在细胞水平有何异常？荧光蛋白的活体成像能观察各种肿瘤模型中肿瘤细胞的生长和发展，包括肿瘤最初的发生，肿瘤细胞随后的迁移和入侵，转移播种，生成血管以及肿瘤和宿主微环境间的相互作用等。荧光蛋白作为报告基因已被广泛应用于肿瘤各个阶段的研究中，本文就近些年来荧光示踪技术在肿瘤细胞发生和发展过程中的研究和应用作一综述。

简介：摘要目的根据IRES末端序列的不同，构建4个GFP表达强度不同的逆转录病毒载体，为后续流式检测或成像提供基础。方法利用脑心肌炎病毒IRES的转录效率依赖于其末端的基因序列，通过重叠PCR方法将IRES与EGFP融合成4个不同连接方式的片段，然后克隆至逆转录病毒载体pMSCV-NGFR中；PCR扩增NGFR片段，克隆至逆转录病毒载体pMSCV-IRES-EGFP前面；逆转录病毒载体pMSCV-NGFR-IRES-EGFP转染293T细胞，分析EGFP的表达比例和平均荧光强度(MFI)，同时分析NGFR的表达。结果成功构建4个逆转录病毒载体pMSCV-NGFR-IRES-EGFP；在293T细胞转染4个逆转录病毒载体，24 h和48 h时EGFP的表达效率没有明显差异，但荧光强度却有明显不同，同时NGFR的表达没有明显不同，说明IRES与EGFP之间加入不同的核苷酸序列，会使EGFP的荧光强度呈现明显差异。结论EGFP的表达强度受IRES与EGFP之间序列的影响，不同强度EGFP的逆转录病毒载体可以适用于不同的实验要求。

简介：绿色荧光蛋白Greenfluorescenceprotein，GFP）最早被Shimomura等学者于1962年从水母（Jellyfish，AequoreaVictoria）发现。在1971年，Morin和Hastings注意到随着水螅体（Hyroid，Obelia）中发光复合物的分离，发光波长迅速变化：当发光复合物中的荧光蛋白从它的光源一水母发光蛋白中解离下来时，发射光从绿色变为蓝色。这些早期的观察标志着GFP的发现。在天然的发光复合物中，GFP把从水母发光蛋白（本质上是一种荧光素酶类的光蛋白）发射的高能量蓝光转换为低能量的绿光。

简介：为制备可视化的转移消失蛋白（MIM）的I-BAR结构域重组体,克隆了顺联绿色荧光蛋白（GFP）探针编码序列的MIM-I-BAR基因.在6xHis标签原核表达质粒上成功构建了DNA序列.同时,实现了未标记荧光探针基因的MIM-I-BAR质粒的构建以作实验对照.成功转染至BL21（DE3）大肠杆菌细胞后,GFP偶联的MIM-I-BAR（MIM-I-BAR-GFP）蛋白表现出很强的可视荧光,该表达产物可方便的通过目测、荧光显微镜、免疫印迹和紫外可见分光光度计等多种手段进行检测.此外,在考察不同条件下的蛋白表达效率过程中发现,带有GFP探针的MIM-I-BAR重组蛋白在温度为10℃时产率最高,而并非37℃.这一特征与非荧光标记的MIM-I-BAR明显不同.研究证实该最佳表达温度条件适用于重组蛋白产品中量制备.所开发的带有荧光探针的MIM-I-BAR蛋白产品及其制备工艺在科学研究、生物医学应用以及药物开发过程中均有较高的应用价值。

简介：绿色荧光蛋白-逆转录病毒（GFP—RV）基因载体，可用于组织工程研究中的细胞标记，具有良好的效果。由于GFP—RV是个假病毒，需要经过一系列的PT67细胞包装、筛选及扩增，成为重组的GFP-逆转录病毒，才能有效转染整合人细胞基因组内，从而形成对目的细胞的长时间的标记。我们将本实验室常用方法介绍如下。

简介：目的本研究构建含绿色荧光蛋白基因的重组慢病毒，并观察其在人椎间盘髓核细胞中的表达情况。方法应用分子克隆技术将绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein，GFP）基因导人慢病毒载体质粒pLenti6／V5TOPO，应用磷酸钙沉淀法将慢病毒载体三质粒系统（包括包装质粒、包膜蛋白质粒等）共转染入293细胞进行包装，48h后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况，72h收集病毒上清并感染髓核细胞，在荧光显微镜下感染情况。结果重组慢病毒滴度测定约为10^7U／mL。感染人椎间盘髓核细胞后，荧光显微镜下观察到GFP的表达。结论成功构建了含GFP的慢病毒载体，且能成功将目的基因转入椎间盘髓核细胞并表达。

简介：目的探讨不同荧光蛋白标记方法对兔骨髓基质干细胞体外增殖能力的影响.方法从兔骨髓中分离培养骨髓基质干细胞,分别采用逆转录病毒和质粒转染两种方式进行增强型绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白标记,G418筛选培养3周后,测定细胞生长曲线和贴壁率的变化.结果逆转录病毒载体pLEGFP-N1、真核表达载体pDsRed2-C1均可以成功标记骨髓基质干细胞,G418筛选培养后,细胞表达明显的荧光蛋白,其阳性率增加.pLEGFP-N1标记组细胞倍增时间为(34.9±1.2)h,pDsRed2-C1组为(36.1±1.4)h,未标记组为(33.8±0.5)h,3组数据间无统计学差异(P＞0.05).结论荧光蛋白标记对骨髓基质干细胞体外增殖无明显影响,合理应用不同荧光蛋白及其表达载体将成为深入研究组织工程种子细胞的有力工具.

简介：背景：利用间充质干细胞或含有治疗因子的干细胞进行有选择性的杀伤肿瘤细胞是一种有前途的治疗方法。目的：建立含稳定转染增强型绿色荧光蛋白的大鼠骨髓间充质干细胞系。方法：通过脂质体介导慢病毒质粒pVector-EGFP、pHelper、Envelope共转染293T细胞完成载体病毒构建,以实时荧光定量PCR检测慢病毒滴度;取对数生长期的SD大鼠骨髓间充质干细胞,以复感染指数MOI值0,5,10,15,20加入携带报告基因增强型绿色荧光蛋白的慢病毒载体稀释液,72h后观察各组增强型绿色荧光蛋白的表达效率及阳性转染率。结果与结论：携带增强型绿色荧光蛋白的慢病毒载体系统转染293T细胞能够正确表达,滴度为1×108TU/mL。包装好的病毒颗粒转染大鼠骨髓间充质干细胞二三天后,各孔均有增强型绿色荧光蛋白的表达。MOI值从0增至10,细胞的阳性表达率逐渐提高（P〈0.05）,MOI值为10的组能获得〉70%的转染率,但MOI值从10增至20,转染率变化不明显。说明以MOI值为10的滴度将慢病毒载体可将外源基因高效转入大鼠骨髓间充质干细胞内,建立含稳定转染增强型绿色荧光蛋白的大鼠骨髓间充质干细胞系。

简介：目的探讨绿色荧光蛋白(GFP)特异性发夹结构RNA(shRNA)对人类胶质瘤BT325细胞系GFP基因表达的抑制作用.方法设计并合成针对GFP基因的shRNA序列,与报告基因质粒pEGFP-N1共转染,选择最佳转染比例,荧光显微镜下观察GFP表达的效率和对GFP的抑制效应.结果质粒pSIREN-RetroQ-RNAi经双酶切得到6kb和100bp条带,结合测序验证,与实验设计的shRNA长度相符.质粒DNA与XP-1转染比例为1:25时GFP表达最强.BT325细胞干扰48h时GFP表达显著减少.结论BT325细胞系中存在RNA干扰现象,且干扰效果特异、稳定;本实验为研究基因功能提供了新的策略.

简介：目的观察绿色荧光蛋白转基因大鼠来源的骨髓间充质干细胞（bonemesenchymalstemcells,BMSCs）在急性脊髓损伤大鼠脊髓组织中的迁移和分化情况。方法全骨髓贴壁培养法培养BMSCs,Allen法制作脊髓损伤大鼠模型,共30只大鼠。于造模1周后进行干预,随机选取造模成功的24只大鼠并随机分为脊髓损伤组、假移植组（生理盐水注射）和细胞移植组（BMSCs注射）,每组8只。于移植前、移植后7d、14d、21d、28d、35d及42d进行BBB（Basso,Beattie＆Bresnahanlocomotorratingscale）评分。HE染色、免疫荧光观察脊髓损伤的组织修复和BMSCs的迁移分化情况。结果从第14天始,细胞移植组大鼠的BBB评分较脊髓损伤组和假移植组大鼠高,差异具有统计学意义（P〈0.05）。HE染色显示细胞移植组大鼠的脊髓结构相对完整,液化和囊泡区缩小,炎性细胞减少。免疫荧光显示BMSCs聚集于脊髓损伤处,且能分化为神经元、神经胶质细胞和神经前体细胞。结论BMSCs能向脊髓损伤部位迁移和聚集,并分化为相应的神经细胞促进脊髓功能恢复。

简介：目的建立红色荧光和绿色荧光转基因小鼠,为活体荧光影像系统建立重要的实验动物模型.方法把DsRed-Express和EGFP基因插入chickenβ-actin强启动子下游构建转基因载体,建立红色荧光和绿色荧光转基因C57BL/6J小鼠.PCR鉴定红色荧光和绿色荧光转基因小鼠的基因表型,活体荧光影像系统分析红色荧光和绿色荧光转基因小鼠,荧光显微镜检测红色荧光和绿色荧光转基因小鼠全身组织器官的组织形态.结果分别建立了3个系的红色荧光和3个系的绿色荧光转基因小鼠.活体荧光影像系统分析转基因小鼠分别呈现红色荧光和绿色荧光.经荧光显微镜观察,DsRed-Express转基因小鼠的红色荧光蛋白在多个组织器官中表达,尤其在胰腺、肝脏、肾脏和脾脏等器官表达量较高.EGFP转基因小鼠绿色荧光蛋白在全身各个组织器官中表达,尤其在胰腺、心脏、小肠、外周血细胞和脑组织等器官组织中表达量较高.结论DsRed-Express和EGFP基因在转基因小鼠中系统性高表达,成功建立了红色荧光和绿色荧光转基因小鼠.DsRed-Express和EGFP转基因小鼠将成为活体荧光影像系统的重要实验动物模型.

简介：