蓬莪术药材的指纹图谱研究

【摘要】  　　目的建立蓬莪术药材挥发性成分的气相色谱－质谱联用分析（GC-MS）指纹图谱，为蓬莪术药材的质量控制提供参考。方法采用水蒸气蒸馏法提取蓬莪术挥发油，用GC-MS联用技术对其进行指纹图谱测定，并且利用“中药色谱指纹图谱相似度评价软件”对不同样品之间的相似度进行计算。结果初步建立了蓬莪术挥发油的GC-MS指纹图谱，标定了20个共有峰，各批次药材均有上述特征，但特征峰的相对含量存在一定差异。结论该方法有良好的重现性和精密度，再加上GC-MS具有多成分同时定性的优势，所建立的蓬莪术挥发油的GC-MS指纹图谱为其质量控制提供了科学依据。

【关键词】  蓬莪术 挥发油 气相色谱-质谱联用 指纹图谱

　　Abstract：ObjectiveTo establish a method of fingerprint analysis on volatile oil of Curcuma phaeocaulis Valeton by GC-MS. MethodsThe essential oil of Curcuma phaeocaulis Valeton growing in Shuangliu city of Sichuan province was extracted by steam distillation and the chromatographic fingerprint was characterized by GC-MS. The GC-MS analysis was carried out in a Hewlett Packard model 6890 gas chromatograph coupled with a Hewlett Packard model 5973 mass detector. A Hewlett Packard HP-5 (5% phenyl methyl siloxane) fused silica capillary column (30 m×0.25 mm I. D., 0.25μm film thickness) was used for the separation. ResultsWe established Mutual fingerprint of the essential oil of Curcuma phaeocaulis Valeton by using the similarity calculation software of Chinese herbal fingerprint designed by Research Center of Modernization of Chinese Herbal Medicines of Central South University RSD of precision and reproducibility and stability of this GC-MS method was in the range of 5%. Compared with Mutual fingerprint of the essential oil of Curcuma phaeocaulis Valeton, the coefficients of 10 samples of the essential oil of Curcuma phaeocaulis Valeton were all above 90%, without abnormal sample.ConclusionThe method is reliable, accurate and can be used for quality control of essential oil of Curcuma phaeocaulis Valeton.

　　Key words：Curcuma phaeocaulis Valeton ;   Essential oils;   GC-MS;   Fingerprint
   
　　莪术是姜科植物蓬莪术Curcuma phaeocaulis Valeton、广西莪术Curcuma kwangsinensis S.G.Lee et C.F. Liang和温莪术Curcuma wenyujin Y.H.Chen et C.Ling的干燥根茎。中医理论认为莪术辛、苦、温，归肝、脾经，具行气破血、消积止痛的功效［1］。莪术挥发油中的β-榄香烯对肿瘤细胞生长有直接抑制作用［2］。莪术油能抑制肿瘤细胞异常增殖［3］。
    
　　莪术油的质量直接关系到其制剂的质量，由于中药材的药效不是来自任何单一的活性成分，任何单一活性成分都不能确切反映中医用药所体现的整体疗效，所以采用任何单一活性成分或指标成分都难以准确评价中药的真伪和优劣。中药产业现代化的瓶颈是质量不可控、安全不可靠［4］。为加强中药生产的质量管理和临床用药的安全，国家药品监督管理局在中药质量标准中引入指纹图谱技术要求。色谱技术测定指纹图谱具有综合、宏观、“模糊”的非线性特点。本研究按照《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》（暂行）和《中药注射剂色谱指纹图谱试验研究操作规程指南》（试行）的规定，首次采用GC-MS对蓬莪术挥发性成分建立指纹图谱。由于不同种、不同产地的莪术药材挥发性成分及含量有较大差异［5］，所建立的中药指纹图谱必须固定药材的种属和产地，因而选定四川省种植的蓬莪术Curcuma phaeocaulis Valeton（道地药材［6］），采用水蒸气蒸馏法提取蓬莪术挥发油，采用GC-MS联用技术测定其指纹图谱，并且利用“中药色谱指纹图谱相似度评价软件”对不同样品之间的相似度进行计算，为蓬莪术药材的综合质量控制提供参考。

　　1  器材
    
　　HP6890/HP5973 GC/MS 联用仪（美国惠普公司）。色谱柱为HP-5MS 5% Phenyl Methyl Siloxane（30 m×0.25 mm×0.25 μm）弹性石英毛细管柱，醋酸乙酯(分析纯，上海化学试剂有限公司)。
    
　　柱温60℃，保持1 min，以10℃·min-1升温至100℃，再以4℃·min-1升温至200℃后，以20℃·min-1升温至280℃，保持2 min；汽化室温度 250℃；载气为高纯He（纯度为99.999%）；柱前压 52.6 kPa，载气流量1.0 ml·min-1；进样量 1 μl；分流比40∶1。离子源为EI源；离子源温度230℃；四极杆温度150℃；电子能量70 eV；发射电流34.6 μA；接口温度280℃；倍增器电压：1 388V；溶剂延迟4 min；质量范围10～550 amu。
    
　　采集10批次四川省种植的蓬莪术（样品由四川成都仙森生物科技有限公司提供），经本实验室的严志坚博士鉴定为Curcuma phaeocaulis Valeton。

　　2  方法与结果

　　2.1  挥发油的提取 

　　取蓬莪术干燥根茎粉碎成粗粉，过0.64 mm筛，称量80 g，加入1 000 ml烧瓶中，加8倍水量，用挥发油提取器提取6 h(提取条件经正交实验优化)，获得具有特殊气味的油状物，用无水硫酸钠除去水分放置于冰箱（-18℃）中备用。

　　2.2  精密度取同一批次样品，在所建立的测定条件下，连续进样5次，实验结果得出TIC图中各色谱峰相对保留时间的RSD在0.29%～1.22%之间,各共有峰的相对峰面积的RSD＜5%，其指纹图谱的相关系数在0.981～0.993之间，符合指纹图谱研究的技术要求。

　　2.3  重复性取同一批蓬莪术药材5份，按样品制备方法制备，并在所建立的测定条件下测定，结果表明，TIC图中各共有峰相对保留时间的RSD在0.41%～1.84%之间，各共有峰的相对峰面积的RSD＜5%，其指纹图谱的相关系数在0.962～0.981之间，符合指纹图谱研究的技术要求。　2.4  稳定性取同一批次样品，在所建立的测定条件下，分别在0，1，2，4，8，12，24 h进行测定，考察各主要色谱峰相对保留值，结果表明各共有峰相对保留时间的RSD在0.36%～1.46%之间，各共有峰的相对峰面积的RSD＜5%，其指纹图谱的相关系数在0.971～0.988之间，符合指纹图谱研究的技术要求。样品在冰箱中-18℃保存6个月后按所建立的测定条件测定，谱图保持不变，表明样品的稳定性好。

　　2.5  指纹图谱的建立及分析按所建立的测定条件对10个四川双流产的蓬莪术药材样品的挥发性成分进行测定，其典型的GC-MS的色谱指纹图谱见图1。有20个主要的共有特征峰（占总峰面积90%以上），选择9号峰为参照峰，此峰为所有蓬莪术样品所共有的，然后分别求出各特征峰的调整保留时间之比（α值）和相对峰面积（峰面积之比）。结果见表1。表1  10批次蓬莪术油特征（峰）成分相对含量（略）
   
　　由于采用的测试手段是GC-MS联用技术，通过HP MSD化学工作站检索Nist98标准质谱图库和WILEY质谱图库，并结合有关文献谱图解析［5～8］，鉴定了16个共有峰。从蓬莪术挥发油的质谱分析结果可知，α值为1.00时，组分是莪术烯（Curzerene）；单峰面积占总峰面积大于20%的共有峰只有1个，就是α值为1.18的组分，质谱检索结果是莪术酮（Curzerenone），该面积比值所允许的误差范围是4.51～5.77。其余的共有峰面积占总峰面积均小于10%。

　　2.6  指纹图谱相似度分析采用国家食品药品监督管理局推荐的“中药指纹图谱计算机辅助相似度计算软件”对测定结果进行计算，10个批次蓬莪术药材（四川产）的相似度分别是0.978，0.957，0.962，0.900，0.905，0.895，0.965，0.900，0.978和0.978。从此结果可以看出，10批次蓬莪术挥发油样本的相似度均在89%以上，未发现离群样本，符合国家食品药品监督管理局对中药指纹图谱相似度的要求。

　　3  小结
    
　　本研究在提取、测试条件等方面经过大量的实验摸索，所建立的GC-MS研究蓬莪术挥发油指纹图谱的方法有良好的精密度、重现性，样品稳定。
    
　　GC-MS具有定性功能的优点，因而采用GC-MS建立挥发油指纹图谱，基本不受色谱柱、不同仪器等条件的限制。即使未鉴定出某些成分，也可根据其质谱“棒形图”进行辨认。
    
　　本研究按照《中药注射剂色谱指纹图谱试验研究操作规程指南》（试行）的规定，采用国家食品药品监督管理局推荐的“中药指纹图谱计算机辅助相似度计算软件”进行计算，使所得到的指纹图谱能全面、综合和准确地反映蓬莪术药材的质量情况，为莪术药材的质量控制提供科学依据，同时也为莪术中药制剂制定指纹图谱研究奠定基础。

   
　　莪术的药用性除了挥发油以外，还有它的醇提部分等，若能结合HPLC或LC-MS等多种分析仪器联用的模式［9］，将能更好地体现中药的整体性和复杂性。

【参考文献】
  　　［1］国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］. 北京：化学工业出版社，2005：230.

　　［2］杨骅，王仙平，郁琳琳,等.榄香烯抗癌作用与诱发肿瘤细胞凋亡［J］.中华肿瘤杂志，1996，18（3）：169.

　　［3］吴万垠，罗云坚，程剑华，等. 莪术油对小鼠肝癌细胞DNA作用的图象分析［J］.中西医结合肝病杂志，1999，9（1）：18.

　　［4］谢培山.中药色谱指纹图谱鉴别的概念、属性、技术与应用［J］.中国中药杂志,2001,26(10):653.

　　［5］周欣，梁光义，沈万雁，等.不同产地莪术挥发油的研究［J］.华西药学杂志, 2002，17（3）：201.

　　［6］肖小河，钟国跃，舒光明，等.国产姜黄属药用植物的数值分类学研究［J］.中国中药杂志，2004，29（1）:15.

　　［7］ADAMS R P. Identification of Essential Oils Components by Gas Chromatography-Mass Spectrometry［M］.Illinois, IL, Allured Publishing Co., 1995, 10.

　　［8］赵树年，陈于澍，谢金伦，等. 萜类化合物大全［M］.昆明：云南科技出版社，1999：705，784，1248.

　　［9］罗国安，王义明，曹 进. 多维多息特征谱及其应用［J］.中成药，2000，22（6）：395.