赤芝菌体中三萜抑菌作用研究

【摘要】  目的检测赤芝发酵菌体中三萜对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌以及黑曲霉和青霉的体外抑菌活性。方法管碟法。结果赤芝菌体三萜化合物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的生长均具有显著抑制作用；对枯草芽孢杆菌、青霉和黑曲霉抑制作用较弱；该三萜样品对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉和青霉的最小抑菌浓度分别为25，25，50，100和50 mg/ml。结论 赤芝发酵菌体中三萜对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和青霉有明显的抑制作用。

【关键词】  赤芝 菌体三萜 抑菌作用 最小抑菌浓度

赤芝Ganodema lucidum，通常称为“灵芝”，是灵芝属最珍贵的药用真菌，具有很高的保健和药用价值。我国古代称其子实体为“仙草”。《中国药典》规定，赤芝和紫芝Ganoderma sinense为灵芝正品［1］。目前卫生部也已批准灵芝为食品新资源；《美国草药药典与治疗概要》也正式收载了灵芝［2］。灵芝的研究已得到亚洲诸多国家以及加拿大、美国和部分欧洲国家的重视［1～6］。

    现代药理学和营养学证实赤芝的关键有效成分是多糖类化合物和三萜类化合物［1～8］。赤芝三萜是近年来发现的灵芝中除了多糖及肽类外又一种具有明显药理活性的化合物，有止痛、镇静、抑制组织胺释放、解毒、保肝、毒杀肿瘤等功能［5～8］。目前国内外以赤芝多糖为主要有效成分的产品为主，而赤芝三萜类产品的开发较晚。目前赤芝三萜的生产技术主要包括从野生或人工栽培的灵芝子实体中提取，以及从孢子和发酵培养物中提取。但由于液体深层发酵技术具有不受季节限制、生产周期短、质量易控制等特点，通过发酵技术生产赤芝三萜已是目前最普遍的方法［9］。近年来，赤芝三萜的药理作用得到了广泛研究，但其抗菌作用的报道较少，作者近年来陆续研究了赤芝菌丝体、发酵液中三萜的抑菌作用。本文则报道赤芝菌丝体中三萜类化合物的抑菌活性。

    1   材料与方法

    1.1  菌种赤芝Ganoderma lucidum，大肠杆菌E. coli，金黄色葡萄球菌Staphylococcal aures，枯草芽孢杆菌Bacilllus subtitis，黑曲霉Aspergillus niger和青霉Penicillium chrysogenum，均由我校生物工程实验室提供。

    1.2  赤芝发酵培养基组成：葡萄糖20 g/L，蛋白胨4 g/L，KH2PO41.5 g/L，MgSO4 0.75 g/L。培养条件：在28℃，140 r/min下培养7 d。

    1.3  赤芝菌体三萜的制备  菌体冷冻干燥后，研成40目左右的粉末，用50%(V/V)乙醇回流提取4 h，离心后获得上清液，旋转蒸发器上完全去除乙醇，补适量水后，再加入适量氯仿于分液漏斗中萃取，反复萃取3次后，合并氯仿层，挥去氯仿后，用正丁醇溶解萃取物，挥去正丁醇，再用无水乙醇振荡提取后作为样品。

    1.4  抑菌实验方法抑菌实验采用管碟法，混菌平板制好后，用无菌镊子取无菌牛津杯置于混菌平板上，杯中加满试样，细菌培养培养20 h，霉菌培养48 h后，测量抑菌圈的直径［10,11］。

    1.5  最小抑菌浓度的确定采用试管连续稀释法。

    2  结果

    在体外测试了各样品在不同浓度下对几种微生物生长的抑制作用（见表1）。由表1可见，赤芝菌体三萜对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长有较明显的抑制作用，而对枯草芽孢杆菌、黑曲霉和青霉的抑制作用较弱。在赤芝菌体三萜浓度为60 mg/ml时，样品对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉和青霉的抑菌圈直径分别为10.01，9.12，6.01，3.12 mm和4.97 mm。提示该赤芝菌体三萜对大肠杆菌的抑制作用最强，而对枯草芽孢杆菌和霉菌的抑制作用较弱。

    为了测试赤芝菌体三萜对这5种菌的最小抑菌浓度，我们采用试管连续双倍稀释法，将样品以2倍的稀释梯度进行了处理，然后测试各浓度下的抑菌作用。表2为采用试管连续双倍稀释法测定赤芝菌体三萜对5种菌的最小抑菌浓度的实验结果。由表2中可以看出，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在赤芝菌体三萜浓度低于25 mg/ml时，仍然可以生长，但当赤芝菌体三萜浓度达到25 mg/ml以上时，不再生长，说明该赤芝菌体三萜对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为25 mg/ml。而枯草芽孢杆菌和青霉在赤芝菌体三萜浓度达到50 mg/ml时，不再生长，因此，该赤芝菌体三萜对枯草芽孢杆菌和青霉的最小抑菌浓度为50 mg/ml。对黑曲霉的抑制作用最弱，只有当浓度达到100 mg/ml时，才能完全抑制其生长，即对黑曲霉的MIC为100 mg/ml。 表1  赤芝菌体三萜的抑菌作用表2  赤芝菌体三萜的最小抑菌浓度实验结果3  讨论

    灵芝是我国十分名贵的药用真菌，赤芝是灵芝中药理作用最强、被研究最广泛的一种，是灵芝的代表。赤芝自古就对慢性支气管炎和哮喘有一定的疗效，故推测赤芝具有抗菌作用。

    《中药大辞典》［12］记载，赤芝水提物浓度在125～500 mg/ml时对肺炎球菌、甲型链球菌、白色葡萄球菌等有一定的抑制作用。王帮武等［13］的研究表明，赤芝子实体中灵芝三萜酸性组分在25 mg/ml时，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长都有显著的抑制作用。李平作等［14］报道了赤芝发酵菌丝体中灵芝酸（三萜化合物，三萜酸）的体外抑菌作用，实验表明，灵芝酸在50 mg/ml时，对大肠杆菌、产气杆菌、肠炎杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌都有一定的抑制作用，但没有测定对各种细菌的最小抑菌浓度。秦莲花等［15］报道，几种灵芝三萜酸对标准结核分枝杆菌和耐药结核分枝杆菌均具有显著抑菌作用。

    本文测试了赤芝菌体中三萜类物质对几种细菌和霉菌的抑菌作用。结果表明，赤芝菌体三萜化合物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的生长均具有显著抑制作用；对枯草芽孢杆菌、青霉和黑曲霉抑制作用较弱；其中，对大肠杆菌的抑制作用强，对黑曲霉的抑制作用最弱。该三萜样品对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度均为25 mg/ml；对枯草芽孢杆菌和青霉的最小抑菌浓度分别为50 mg/ml；而对黑曲霉的最小抑菌浓度为100 mg/ml。

【参考文献】
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［15］ 秦莲花，王 洁，杨 华，等.灵芝对结核分枝杆菌体外抑菌作用的研究［J］.同济大学学报（ 医学版）, 2006, 27(4): 17.