议凝胶色谱法分离蛋白质

议凝胶色谱法分离蛋白质

叶月萍

叶月萍

摘要：凝胶色谱法是根据分子量的大小分离蛋白质的方法之一。相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。具体过程包括：凝胶色谱柱的制作，凝胶色谱柱的装填，样品加入和洗脱。要求我们谨慎操作才能成功得到移动均匀一致的蛋白质区带。

关键词：凝胶色谱法；凝胶；溶剂；凝胶色谱柱；分离度；洗脱

凝胶色谱法又叫分配色谱法，是根据分子量的大小分离蛋白质的方法之一。凝胶是一些由多糖类化合物构成的多孔球体，当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质直径小于凝胶网孔，由于静电吸附和扩散作用容易进入凝胶内部的通道，可以自由地进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动的过程中，它们从凝胶颗粒的网孔扩散到凝胶颗粒间的孔隙，再进入另一凝胶颗粒的网孔，如此不断地进出，使流程增长，而最后流出层析柱。而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶颗粒的网孔，只能沿着凝胶颗粒间的孔隙，随着洗脱液流动，流程较短，因此首先流出层析柱。分子量介于二者之间的物质，虽然能够进入凝胶网孔，但比小分子难，因此进入凝胶网孔的几率比小分子小，向下移动的速度比小分子快，而比大分子慢。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。具有多孔的凝胶又称分子筛。笔者主要从以下两方面来探讨凝胶色谱法，并结合具体的例题来解析其具体的应用。

一、凝胶色谱法的分类

根据分离的对象是水溶性的化合物还是有机溶剂可溶物，可分为凝胶过滤色谱法和凝胶渗透色谱法。

凝胶过滤色谱法一般用于分离水溶性的大分子，如多糖类化合物。凝胶的代表是葡萄糖系列，洗脱溶剂主要是水。

凝胶渗透色谱法主要用于有机溶剂中可溶的高聚物(聚苯乙烯、聚氯已烯、聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等)相对分子质量分布分析及分离，常用的凝胶为交联聚苯乙烯凝胶，洗脱溶剂为四氢呋喃等有机溶剂。

二、凝胶色谱分离蛋白质的过程

1.凝胶色谱柱的制作

取长100cm，内直径2cm的玻璃管，两端需用砂纸磨平。底塞打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。

其中层析柱的直径大小不影响分离度，样品用量大，可加大柱的直径，一般制备用凝胶柱，直径大于2厘米，但在加样时应将样品均匀分布于凝胶柱床面上。此外，直径加大，洗脱液体体积增大，样品稀释度大。

分离度取决于柱高，为分离不同组分，凝胶柱必须有适宜的高度，分离度与柱高的平方根相关，但由于软凝胶柱过高挤压变形阻塞，一般不超过1米。分组分离时用短柱，一般凝胶柱长20-30厘米，柱高与直径的比较5：1─10：1，凝胶床体积为样品溶液体积的4-10倍。分级分离时柱高与直径之比为20：1─100：1，常用凝胶柱有50×25厘米，10×25厘米。

注意事项：

(1)底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，导致蛋白质分离不彻底。

(2)层析柱滤板下的死体积应尽可能的小，如果支撑滤板下的死体积大，被分离组分之间重新混合的可能性就大，其结果是影响洗脱峰形，出现拖尾出象，降低分辨力。在精确分离时，死体积不能超过总床体积的1/1000。

2.凝胶色谱柱的装填

计算并称取一定量的交联葡聚糖凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。将色谱柱装置固定在支架上，将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内，凝胶沉集后，将溶剂放出至胶面不再下降，并且通过2～3倍柱床体积的溶剂（20mmol/L的磷酸缓冲液，pH7．0）使柱床稳定。装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用300mL的20mmol/L的磷酸缓冲液（pH为7．0）充分洗涤平衡12h。

注意事项：

(1)为了加速膨胀，可用加热法，即在沸水浴中将湿凝胶逐渐升温至近沸，通常在1-2小时内即可完成。特别是在使用软胶时，自然膨胀需24小时至数天，而用加热法在几小时内就可完成。这种方法不但节约时间，而且还可消毒，除去凝胶中污染的细菌和排除胶内的空气。

(2)凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙；装填凝胶柱时不得有气泡存在，因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果；液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动，从而影响生物大分子物质的分离效果；注意不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。

3.样品加入和洗脱

调节缓冲液面→加入蛋白质样品→调节缓冲液面→洗脱→收集分装蛋白质。至此，蛋白即可得到粗分离。色谱柱成功标志：蛋白质区带均匀一致地移动。

注意事项：

(1)加快流速会降低分离效率，因为凝胶色谱是一个由扩散控制的分离过程，高分子在溶液中扩散较慢，这就必然使流速受到一定限制。

(2)凝胶色谱峰容量较小的原因是和分离机理有关。这些缺陷的克服都可通过填料柱效的提高解决。高效凝胶色谱填料的合成成功以及高效装柱技术的发展，实现了柱效的提高，从而实现了实验时间缩短，峰宽变窄和峰容量增加。

以上是关于凝胶色谱法的一些原理性地知识，下面笔者主要结合一些例题来看一下该方法在解题过程中的应用。

例1：利用凝胶色谱法，什么样的蛋白质先洗脱出来（）

A.相对分子质量大的B.溶解度高的

C.相对分子量小的D.所代电荷多的

解析：凝胶色谱法根据相对分子质量的大小分离蛋白质的方法。相对分子量较小的蛋白质能进入凝胶内部通道，路程较长，所花时间多；相对分子量大的蛋白质，路程较短，所花时间少，首先洗脱出来。

答案：A

例2：用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量大的蛋白质（）

A.路程较长，移动速度较慢B.路程较长，移动速度较快

C.路程较短，移动速度较慢D.路程较短，移动速度较快

解析：凝胶色谱法根据相对分子质量的大小分离蛋白质的方法。相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。

答案：D

总之，用凝胶色谱法分离蛋白质是一种很好的办法，因此，在教学中，我们要加强对该知识的教学，保证学生能够掌握它，从而使其将化学掌握得更好。

参考文献：

[1]汪忠.普通高中课程标准实验教科书生物技术实践选修1第二版[S].江苏：江苏教育出版社，2011.

[2]龙小波.DNA和蛋白质技术[N].考试报,2012(2).

作者单位：陕西省榆林市定边县定边中学

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