P16基因甲基化检测在肺癌早期诊断中的应用研究

P16基因甲基化检测在肺癌早期诊断中的应用研究

张继华李晓张毅蔡远玲高明周云春

张继华李晓张毅蔡远玲高明周云春(云南省玉溪市人民医院653100)

【摘要】目的采用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)检测NSCLC患者p16基因的甲基化状态，探讨p16基因甲基化与肺癌发病的关系以及其对肺癌的早期诊断价值。方法实验分两阶段进行。结果A组患者四种标本中P16基因甲基化率分别为50%，46.43%，51.79%，53.57%；B组2例COPD合并吸烟患者支气管肺泡灌洗液，1例痰标本中检测到P16基因甲基化；C组健康对照者标本中均未检测到P16基因甲基化。D组患者四种标本中P16基因甲基化率分别为48.27%，50.00%，56.89%(33/58)，58.60%。结论肺癌患者四种标本中P16基因甲基化率明显高于非肺癌患者及健康人，而非肺癌患者（包括慢阻肺病人）和健康人甲基化率无明显差别，检测p16基因甲基化可用于肺癌的早期诊断及筛查。

【关键词】DNA甲基化肺泡灌洗液血清肺癌

【中图分类号】R730.4【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2013）46-0067-02

肺癌是目前世界范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，与30年前相比，我国肺癌死亡率上升了465%[1]，肺癌的早期诊断对改善预后至关重要，因此，在我国积极探索发展肺癌的早期诊断研究具有非常重要的现实意义，DNA甲基化水平变化的检测对肿瘤的早期诊断、疗效观察及预后判断提供非常有价值的信息[2]。

DNA甲基化与肿瘤的发生密切相关,甲基化可导致抑癌基因、生长调节基因启动子区域的高甲基化，是癌症发生的重要机制[3]。细胞周期依赖的激酶抑制剂在早期肺癌中约有20%出现不同程度的甲基化，而在正常肺组织中这个基因没有发现甲基化的存在[4]。阿片样物质结合蛋白/细胞粘附分子OPCML为一种抑癌基因，被抑制可引发肺癌的尼古丁逆转[5]。研究发现该基因的启动子甲基化与肺鳞癌和腺癌发病相关，在肺鳞癌中发现HOXA7-9的甲基化频率达到45%-80%[6]。CDX是另外一种编码同源异性盒转录因子的基因，在鳞状食管癌和结肠癌[7]以及肺癌[8]中都发现该基因的启动子区域出现高甲基化现象。Fujiwara等[9]为了评估外周血清DNA甲基化检测诊断早期肺癌的价值，应用甲基化特异性聚合酶链反应（PCR）技术,对经X线普查发现肺部有异常病灶，需行支气管纤维镜检查的200例患者血清五种肿瘤相关基因DNA甲基化状态进行了检测，结果得出使用一种以上肿瘤相关基因甲基化检测对肺癌诊断的敏感度为49.5%,特异度为85.0%。

P16抑癌基因又称MTS1基因或CDKN2基因，是人们发现的第一个直接作用细胞周期抑制细胞分裂的抑癌基因[10]。当抑癌基因p16发生突变，它的编码蛋白表达水平将会下降或消失，失去原有的生物学功能，导致肿瘤的发生，从分子水平上分析p16基因表达的机制[11]。随着对甲基化研究的进一步深入和联合分析将有利于提高肿瘤诊断率，必将在肿瘤的早期诊断、监测高危人群、判断肿瘤预后及其它领域得到更加广泛的应用。

资料与方法

一、一般资料

第一阶段研究

A组：收集2009-2013年间在本院住院治疗的56例NSCLC患者外周血血清、痰、经支气管镜肺泡灌洗液、活检组织标本。入组条件：经病理组织确诊的NSCLC患者。

B组：收集2010-2013年间在玉溪市人民医院住院治疗的20例肺良性疾病患者外周血血清、痰标本、肺泡灌洗液，入组条件：经症状、实验室检查证实为非肺癌患者。

C组：收集20例健康者的外周血血清、诱导痰标本作对照组。入组条件：经询问病史、胸部CT、心电图排外肿瘤及心血管病变。

第二阶段研究

D组：收集2009-2013年间本院及昆明医科大学第一附属医院单侧肺部孤立占位病灶，并接受手术切除的患者79例，术前留取患者外周血、痰液、支气管肺泡灌洗液标本，进行甲基化检测；术后进行病理分析，同时组织标本进行DNA甲基化检测。入组条件：可疑Ⅰ期以内肺癌患者（遵照肺癌TNM国际分析），即肺部CT检查为单侧肺部孤立占位，病灶直径8-15mm，未见到同侧或对侧淋巴结肿大，纤支镜检查未见增生阻塞，经过常规检查不能明确占位性质，愿意接受手术治疗者。

四组入选患者一般特征及各参数之间差异无统计学意义，见表一。

二、方法

2.1按照标准的标本采集方法分别对A、B、C、D四组中的实验对象进行以上四种标本的采集；提取DNA后用甲基化特异性MSP方法进行定性检测。

2.2各组实验数据的计算方法：甲基化率(%)=发生甲基化的标本数/总的标本数×100%。

2.3应用SPSS13.0统计软件对分类资料进行χ2检验，若P＜0.05，则差异有统计学意义，若P＞0.05，则差异无统计学意义。

结果

1、A组患者任一标本或者多种标本检测到P16基因甲基化者35例(62.5％)，其中血清标本阳性28例（50.00%），痰标本阳性26例（46.43%），肺泡灌洗液阳性29例（51.79%），组织标阳性30例（53.57%），详见表二。

2、B组患者中COPD合并吸烟的患者2例支气管肺泡灌洗液，同时1例痰标本检测到P16基因甲基化，其余均未检测到任何基因启动子区甲基化。C组健康人血清、痰标本中P16基因均未检测到任何基因启动子区甲基化，详见表二。

3、D组患者术后病理诊断证实为肺癌者71例（89.8%），其中腺癌36例（50.7%），鳞状细胞癌22例（31.0%），小细胞癌13例（18.3%）。术后58例非小细胞肺癌中四种标本中任一标本或者多种标本检测到P16基因甲基化34例（58.6%），四种标本p16基因甲基化阳性率比较详见表三。13例小细胞肺癌组织标本、痰及肺泡灌洗液标本检测到p16基因甲基化2例（15.3%）。一例炎性假瘤患者支气管肺泡灌洗液及组织标本检测到p16基因甲基化阳性表达。

4、所有痰标本、血清、支气管肺泡灌洗液中检测到异常甲基化的患者，其活检组织也能检测到相应基因的异常甲基化，配对χ2检验结果表明肺癌组织的基因甲基化率与痰、血清、支气管肺泡灌洗液标本DNA甲基化率存在着较好的一致性（p>0.05，Kappa=0.954），见表一，表二，表三。

表一四个实验组入组条件及基础情况

讨论

表观遗传学的研究表明，肿瘤的形成往往伴随着抑癌基因启动子区域CpG岛的异常甲基化修饰[12]。DNA甲基化检测尤其是p16、MGMT等基因甲基化检测已成为肺癌诊断研究中的热点之一[13]。p16基因位于人类染色体9p2l区，其编码蛋白为P16，P16基因是非小细胞肺癌最易发生甲基化的基因，大量研究结果表明，P16基因甲基化检测有望成为非小细胞肺癌早期诊断的重要指标之一[11]。

本实验采用MSP法检测A组患者以上四种标本中P16基因甲基化情况，结果显示：A组四种标本中P16基因甲基化率分别为50%，46.43%，51.79%，53.57%。D组患者术后诊断非小细胞肺癌58例，该58例患者四种标本中P16基因甲基化率分别为48.27%，50.00%，56.89%，58.60%；而小细胞肺癌13例标本检测到DNA甲基化2例（15.3%）。一例炎性假瘤患者支气管肺泡灌洗液及组织标本检测到p16基因甲基化阳性表达。B组患者血清、痰标本、肺泡灌洗液p16基因甲基化检测，除2例COPD且吸烟患者阳性10%（2/20）外，其余均阴性。C组健康人血清、痰标本中均未检测到P16基因甲基化。可见肺癌患者中四种标本的P16甲基化率明显高于非肺癌患者及正常人，而非肺癌患者（包括慢阻肺病人）和正常人甲基化率无明显差别，并且比较了同一个病人四种标本中MSP检测的灵敏度，结果显示痰标本、肺泡灌洗液、血清和组织标本的灵敏度无明显差异性。由于组织标本很难得到，且为有创操作，病人难以接受而痰标本取材方便、无创伤，可操作性强，经济，患者易接受，因而检测痰标本p16基因甲基化有望成为肺癌的早期诊断标准之一，对于痰标本难以取得的患者，可采取第二方案，进行支气管镜下收集肺泡灌洗液检测以补充协助诊断。

国内外对于P16基因甲基化在肺癌的早期诊断中有相关的报道。BeIinsky等应用MSP技术检测肺癌患者的病理活检组织和痰标本，结果显示p16基因异常甲基化在肿瘤发生演变的组织增生和化生阶段已经出现，是肺癌发生的早期事件[14]。Vaissière等通过多中心5年的研究发现p16基因甲基化与非小细胞型肺癌患者的年龄和性别无关，而与患者吸烟的程度显著相关[13]。

国内外对于甲基化检测用于肺癌诊断的研究目前尚未有明确共识，处于探索阶段，需更深入的探讨。由于选取标本及检测基因不同，检测基因的个数也不同，导致研究结果存在差异。随着分子技术的发展，利用外周血血清、痰、支气管肺泡灌洗液、组织等标本检测肺癌的早期分子事件已经成为研究热点[14]。

总之，我们认为对活检组织、肺泡灌洗液、痰液和血清的p16基因启动子进行甲基化检测，再结合脱落细胞学以及病理学手段，有望提高肺癌的早期检出率。

参考文献

[1]Xiao,T.,L.Bao,andH.Ji,Findingbiomarkersfornon-smallcelllungcancerdiagnosisandprognosis.FrontiersinBiology,2012.7(1):p.14-23.

[2]Lewandowska,J.andA.Bartoszek,DNAmethylationincancerdevelopment,diagnosisandtherapy—multipleopportunitiesforgenotoxicagentstoactasmethylomedisruptorsorremediators.Mutagenesis,2011.

[3]Das,P.M.andR.Singal,DNAMethylationandCancer.JournalofClinicalOncology,2004.22(22):p.4632-4642.

[4]Merlo,A.,etal.,5[prime]CpGislandmethylationisassociatedwithtranscriptionalsilencingofthetumoursuppressorp16/CDKN2/MTS1inhumancancers.NatMed,1995.1(7):p.686-692.

[5]Maneckjee,R.andJ.D.Minna,Opioidsinducewhilenicotinesuppressesapoptosisinhumanlungcancercells.Cellgrowth&differentiation:themolecularbiologyjournaloftheAmericanAssociationforCancerResearch,1994.5(10):p.1033-1040.

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[7]Guo,M.,etal.,EpigeneticsilencingofCDX2isafeatureofsquamousesophagealcancer.InternationalJournalofCancer,2007.121(6):p.1219-1226.

[8]Anglim,P.,etal.,IdentificationofapanelofsensitiveandspecificDNAmethylationmarkersforsquamouscelllungcancer.MolecularCancer,2008.7(1):p.62.

[9]Fujiwara,K.,etal.,IdentificationofEpigeneticAberrantPromoterMethylationinSerumDNAIsUsefulforEarlyDetectionofLungCancer.ClinicalCancerResearch,2005.11(3):p.1219-1225.

DNAMethylationinLungCancer.NewEnglandJournalofMedicine,2008.358(23):p.2513-2514.

[11]!!!INVALIDCITATION!!!

[12]Scesnaite,A.,etal.,SimilarDNAmethylationpatterninlungtumoursfromsmokersandnever-smokerswithsecond-handtobaccosmokeexposure.Mutagenesis,2012.27(4):p.423-429.

[13]Vaissière,T.,etal.,QuantitativeAnalysisofDNAMethylationProfilesinLungCancerIdentifiesAberrantDNAMethylationofSpecificGenesandItsAssociationwithGenderandCancerRiskFactors.CancerResearch,2009.69(1):p.243-252.

[14]Belinsky,S.A.,etal.,Predictinggenepromotermethylationinnon-small-celllungcancerbyevaluatingsputumandserum.BrJCancer,2007.96(8):p.1278-1283.