bFGF和VEGF在幼兔骺板损伤后骨桥形成过程中的表达

bFGF和VEGF在幼兔骺板损伤后骨桥形成过程中的表达

张天久俞松杨小红吕欣徐艳朋罗宇

（遵义医学院附属医院小儿骨科贵州遵义563003）

【摘要】目的：探讨幼兔骺板损伤后骨桥形成过程中碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和血管内皮生长因子(VEGF)的表达情况，为治疗儿童骺板损伤提供实验依据。方法：选取4周龄实验用大白兔20只，用直径4.5mm的克氏针制作右侧股骨远端骺板中央型骺板损伤模型，左侧作为正常对照侧；将幼兔随机分成五组，每组4只，分别于术后第3天、1周、2周、4周、8周处死，采用免疫组化法检测骺板损伤区组织和正常对照侧组织中bFGF和VEGF的表达情况，结果进行统计学分析。结果：bFGF在实验侧骺板损伤区组织中呈阳性表达，第4周达到高峰，第8周阳性率降低，与正常对照侧比较，在术后第3天、1周、2周、4周及第8周差异均有统计学意义（P＜0.05）；VEGF在实验侧骺板损伤区及邻近组织均有阳性表达，第2周达到高峰，之后逐渐下降，与正常对照侧比较，术后第3天、1周、2周及第4周差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：幼兔骺板损伤后骨桥形成过程中bFGF和VEGF都呈较高水平的表达，提示bFGF和VEGF与骺板损伤后骨桥形成密切相关，是促进骨桥形成的重要细胞因子。

【关键词】碱性成纤维细胞生长因子；血管内皮生长因子；骺板；骨桥

【中图分类号】R68【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2017）21-0209-03

骺板损伤是儿童特有且常见的骨折类型，可引起肢体的短缩和成角畸形，导致儿童肢体生长发育障碍的一种严重疾患。防治骺板损伤后发生早闭及其所致畸形，是儿童骨科需解决的的重大难题之一。目前认为在骺板损伤后，“血管桥”的形成是骨桥形成的前提，即新生血管首先侵入骺板损伤区，在此基础上进一步转变而形成骨桥组织[1]。因调控骺板生长发育的机制复杂，已发现有多种生长因子参与，研究表明碱性成纤维细胞生长因子（basicfibroblastgrowthfactor，bFGF）和血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)在骺板的生长发育过程中发挥着重要作用[2,3]。目前骺板损伤后骨桥形成的分子机制不清，本实验通过制作幼兔骺板损伤动物模型，了解bFGF和VEGF在骺板损伤区组织中的表达情况，初步探究骨桥的形成机制，相关实验报道如下。

1.材料与方法

1.1幼兔股骨远端骺板损伤动物模型的建立和分组

4周龄实验用新西兰大白兔20只，雌雄不限，戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，取膝关节前外侧切口，常规消毒，暴露出膝关节及股骨远端软骨中间部分，用直径约4.5mm克氏针，从股骨远端内外侧髁间经软骨逆形钻入至股骨髓腔，造成股骨远端中央型骺板损伤。将幼兔右侧股骨远端骺板损伤作为实验侧，左侧未做损伤作为正常对照侧。

术后将20只幼兔随机分成五组，每组4只，分别于术后第3天、1周、2周、4周、8周用空气栓塞处死。取骺板损伤区及邻近组织约8mm×8mm大小用40g?L-1甲醛溶液固定备用。

1.2主要试剂兔抗兔bFGF抗体和兔抗兔VEGF抗体（一抗），抗体稀释液，二步法抗兔型免疫组织化学检测试剂盒（包括二抗及DAB显色剂）均由美国Gene公司提供。

1.3免疫组织化学染色

骺板损伤区组织均以40g?L-1中性甲醛固定，组织脱钙后常规石蜡包埋切片，厚度4mm，粘附于涂有多聚-L-赖氨酸的载玻片上，60℃烤箱2～3h；将石蜡切片常规脱蜡水化后，滴加30g?L-1过氧化氢室温孵育15min以消除组织内源性过氧化物酶的活性，放入装有10mmol/LPH6.0柠檬酸缓冲液的高压锅中行抗原修复30min后自然冷却，PBS浸泡5min×3次；滴加一抗并于湿盒中4℃冰箱过夜；PBS冲洗并浸泡5min×3次，滴加二抗，室温孵育30min；PBS浸泡5min×3次，滴加预备好的DAB显色剂工作液，光镜下控制显色；蒸馏水冲洗，苏木素复染，各级乙醇脱水、透明、封片，镜下观察。

1.4结果判断bFGF和VEGF显示强度判定

细胞浆被染成棕黄色为阳性，1%～33%的细胞显色为（+），34%～66%的细胞显色为（++），67%~100%的细胞显色为（+++），无细胞显色为（-）。阳性指数检测方法：用Olympus显微镜在400倍下对每张免疫组化染色切片随机选取10个视野，用图像分析软件进行处理，在采集的图像中选取固定的面积进行颗粒分割，根据染色最强的阴性细胞和染色最弱的阳性细胞灰度值，结合计算机测定的阳性强度均值确定阳性染色的灰度值，进行颗粒面积统计，得出阳性染色面积占所测定面积的百分比，乘以阳性强度均值作为阳性指数[4]。

1.5统计学分析

应用SPSS16.0软件进行统计学处理，所有数据用x-±s表示，数据进行比较时采用t检验，检验水准为α＝0.05。

2.结果

实验过程中大部分动物存活状态均良好，死亡2例，局部感染1例，不影响实验结果，顺利完成实验。

2.1骺板损伤区组织bFGF表达情况

在术后第3天～第8周，bFGF在实验侧骺板损伤区有不同程度的阳性表达。免疫组化阳性指数表明，bFGF在术后第3天开始有少量表达，之后表达逐渐增强，在第4周时达到最高峰，到第8周时bFGF表达降低。根据阳性指数结果表明，在术后第3天、1周、2周、4周及第8周实验组均大于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

2.2骺板损伤区组织VEGF表达情况

在术后第3天～第8周，实验侧VEGF在骺板损伤区及周围细胞都有不同程度的阳性表达。免疫组化阳性指数表明，VEGF在术后第3天开始表达，之后表达逐渐增强，在第2周时达到最高峰，到第4周骨桥组织形成，VEGF表达降低，第8周时VEGF表达降到最低值。根据阳性指数结果表明，在术后第3天、1周、2周、4周实验组大于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），术后第8周实验组稍大于对照组，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

3.讨论

3.1幼兔骺板损伤动物模型的建立和骨桥的形成

骺板损伤是儿童骨科的常见病及多发病，易导致骨桥形成、骺板早闭，引起肢体短缩或成角畸形，继而造成肢体功能障碍，给患儿的生长发育及心理健康造成巨大的影响。引起骺板损伤的外力很复杂，不同外力、不同个体均可形成不同的骺板损伤类型，因此，在制作动物骺板损伤模型上没有统一标准，各有优缺点。目前比较常用的方法有克氏针钻孔法、磨钻法、直接刮除法、凿除法、重锤敲击法等。本实验采用克氏针钻孔法制作动物模型，虽与临床上常见的骺板损伤机制不相同，但能很好的模拟骺板损伤后骨桥形成的过程，探寻骨桥形成的机制。目前认为在骨桥形成中，“血管桥”的形成是骨桥形成的前提，即在骺板损伤后，新生血管首先在骺板损伤区形成，而且骨骺端、干骺端血管在骺板损伤区相互汇合，导致骨骺端与干骺由原来的正常骺板软骨相隔离而变为由血管所连接，在此基础上进一步演化而形成骨桥组织。

3.2bFGF和VEGF在骺板损伤后修复过程中的表达和骨桥形成的关系

在体外实验和骺板骨化过程中发现，bFGF、VEGF等在骺板生长发育中起重要作用[5,6]，bFGF可以诱导骨髓间充质干细胞成骨，并且促进其增殖；VEGF在骺板正常骨化中具有重要作用，可以诱导新生血管长入骺板肥大细胞层，为成骨提供条件，也是目前研究中发现的促进血管生长最重要的一种细胞因子。骨折在的愈合过程中后离不开新生血管的形成，而bFGF和VEGF是促进血管形成和生长的两种重要的细胞因子，在骨折愈合过程中，bFGF能够诱导间充质细胞向成软骨细胞分化，诱导成纤维细胞、成软骨细胞和成骨细胞的增殖，促进骨折的修复和愈合；还有研究表明，bFGF不仅能促进狗胫骨骨折后骨痂的形成，增加骨痂的骨矿含量，而且还能促进破骨细胞性骨痂的吸收[7-8]。VEGF可促进内皮细胞的分裂、增殖、迁移和诱导血管形成，还能直接作用于成骨细胞，增加其移动和分泌功能，还通过促进局部血管增生和成骨细胞分化而参与了成骨活动，促进骨折的愈合。bFGF与VEGF对骨骼的生长发育和骨折的愈合具有协同作用[9-10]。

本实验研究表明bFGF和VEGF在损伤后第3天开始表达，分别的第4周和第2周达到高峰，之后表达逐渐降低，说明bFGF和VEGF参与了骺板损伤区“血管桥”的形成，促进骨细胞的分化和增殖，从而促进了骨桥组织的形成，当bFGF和VEGF的表达降低到相应水平时，说明骺板损伤区骨桥组织修复完成。本研究进一步说明了新生血管的形成对骺板损伤区骨桥组织形成的重要性，骺板损伤后骨桥形成的过程类似于骨折修复和愈合的过程。当然，骨桥形成的分子机制比较复杂，仍需要进一步研究。

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