高危型人乳头瘤病毒检测方法研究进展

高危型人乳头瘤病毒检测方法研究进展

刘琳

（达州市中心医院病理科四川达州635000）

【摘要】高危型人乳头瘤病毒（High-riskhumanpapillomavirus，HR-HPV）持续感染是宫颈癌发病的明确病因，检测HPV对宫颈癌的筛查、预防、疗效对比、临床随访具有重要意义。本文围绕HPV检测方法的进展作一综述。

【关键词】人乳头瘤病毒；宫颈癌；HPVE6/E7mRNA；检测方法

【中图分类号】R446.3【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2017）31-0005-02

宫颈癌是全球女性最常见的恶性肿瘤，占所有癌症的9.8%[1]。发展中国家妇女的宫颈癌发生率和病死率较高，占全球患病总人数85%以上[2]。鳞状细胞癌是宫颈癌最常见的组织学类型，高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)感染与宫颈鳞状上皮肿瘤形成之间的强相关系已经确定，累积的实验性、分子学和临床证据表明，HR-HPV感染可直接影响宫颈鳞状上皮肿瘤形成的发病机制[3]。像鳞状细胞癌一样，HPV也是宫颈腺癌最重要的危险因素[4]。至少90%的宫颈腺癌含有人乳头瘤病毒[3]。宫颈癌的发生发展是由量变到质变、渐变到突变的连续发展过程，这些前驱病变可存在多年。在30岁以下（18～28岁）性生活活跃的年轻妇女中HPV感染机会在4%～15%，终身积累概率达60%以上，而多数感染只是一种“一过性HPV携带状态”，即多数女性可自行清除，平均时间是8个月。持续感染8～24个月可发生上皮内病变（CIN），再持续感染8～12年可发生浸润性癌。明确的致病因素和缓慢的发病过程为宫颈癌的普查普治提供了宝贵的时机。循证医学证据表明，筛查是防治宫颈癌的有效手段。本文着重围绕HPV感染在宫颈癌筛查中的检测方法加以综述。

1.形态学方法

主要包括细胞病理学检测、电镜技术等。细胞学检测简单易行，但灵敏度不高，目前广泛使用的有传统巴氏涂片和薄层液基细胞学检测两种。凹空细胞是HPV感染的主要形态学改变，但由于其他病毒感染及人为因素均可造成细胞内出现空泡或凹空样变，且细胞学检查易受取材、制片及阅片者主观因素的影响，故应用细胞学检测HPV存在特异性差、灵敏度低、假阴性和假阳性率高、不能对HPV进行分型等缺点。电镜可以直接观察病毒颗粒，但由于阳性率低，且设备昂贵，目前多用于科研。

2.免疫学方法

利用抗原-抗体特异性反应，检测人体组织或血清中，有无HPV病毒抗原或针对HPV产生的抗体。原理明确，操作相对简单。

2.1免疫组化法

免疫组化法通过抗HPVL1蛋白抗体与对应的HPV外壳蛋白反应来检测HPV，对诊断HPV感染有很强的说服力，操作简单，能准确定位。但由于L1蛋白在感染的较迟阶段表达于表皮浅层，在病毒复制周期表面抗原未表达阶段，免疫组化结果可呈阴性。故免疫组化检测HPV存在假阴性较高及灵敏度较低等缺点，且不便于对HPV进行分型。目前多用于低危型HPV感染导致的湿疣性病变的诊断，而几乎不用于高危型HPV的检测。

2.2血清学检测方法

包括采用免疫沉淀法测定血清中的HPV16抗体水平、用血清免疫吸附试验（ELISA）检测血清中的HPV、E6、E7特异性抗体等。HPV血清学检测属于型特异性，用来提示既往或当前感染，其对象是抗原和抗体。由于人体对HPV产生免疫应答有一定的迟滞性，所以血清学对无免疫应答者和HPV潜伏期感染者会产生漏检。由于HPV至今尚不能在体外培养，其免疫原性较弱，故血清学方法检测敏感度较低，且缺乏标准化和重复性，并未被临床广泛采用。

3.HPV基因组检测方法

是一系列针对病毒基因的检测方法。

3.1原位杂交法

其原理是采用荧光、生物素、地高辛等标记探针，依据碱基互补配对原理，与组织切片、细胞制片等标本中的靶序列特异杂交，经信号放大显色后，镜下观察结果。HPV整合状态的出现与病变组织的恶性进展密切相关。此方法可根据阳性颗粒的大小、形态区分病毒的游离状态或整合状态，但受观察者的主观因素影响很大。由于杂交链的稳定性不高，在杂交过程中部分探针单链复性，使杂交率降低，影响HPV-DNA的检出率。总体来说，原位杂交技术检测HPV有能做定位检测，假阳性率低，但灵敏度不高。由于新技术的发展和应用，该方法用于检测HPV逐渐被取代。

3.2以聚合酶链式反应（PCR）法为基础的检测方法

以聚合酶链式反应为基础的检测方法是用PCR法先进行目的基因的扩增，然后再用各种方法进行检测。

（1）传统PCR，是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制。PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。通过不同的引物设计（通用型引物或特异型引物），可对HPV感染进行诊断和分型。该法有较高的敏感度，缺点是对实验室环境要求较高，容易发生样本间的交叉污染，从而导致假阳性率高。用PCR技术检测HPV-DNA，只要病毒基因有一小个片段被整合到宿主细胞核内就能被检测出来，因此PCR-HPV阳性的病例在病理组织学上所见可从正常到低分化的肿瘤。PCR-HPV检测是从病因做宫颈癌筛查，理论上其为阳性者，患者从潜伏期及癌症晚期均可存在。

（2）巢式PCR，为一种变异的PCR。传统的PCR只是用1对引物，而巢式PCR使用2种引物。其中第1对引物的扩增片段与传统PCR相似；第2对引物又叫巢式引物，其扩增片段结合在第1次PCR产物内部。如果第1次扩增产生了错误片段，则第2次扩增的概率很低，从而提高了反应的特异性，保证了整个反应的准确性及可行性。

（3）实时荧光定量PCR（real-timequantitativePCR，RQ-PCR）：是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该方法将普通PCR的高灵敏性、DNA杂交的高特异性和光谱技术的高准确性有机的结合，客服了穿冲PCR在许多方面的不足和局限性，对DNA模板定量的准确性与特异性都有很大提高。RQ-PCR检测可以一次同时检测多种HPV亚型的DNA，对于大规模的宫颈癌筛查是适用的。

（4）逆转录PCR（reversetranscriptionPCR）或者称反转录PCR（reversetranscription-PCR,RT-PCR），是聚合酶链式反应（PCR）的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。HPVDNA检测仅能够发现病毒的存在与否，却不能反应病毒的致癌活性。近年来的新技术更倾向于将检测对象集中于致癌基因E6、E7的表达。RT-PCR检测可用于对提取的HPVE6/E7RNA逆转录后进行扩增并定量分析。

3.3第二代杂交捕获法(hybridcapture2，HC2)

HC2是最早通过美国FDA批准可在临床使用的HPVDNA检测方法，可检测13中高危型HPV亚型（16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68）。其原理是应用高效的液相RNA:DNA杂交方法捕获样品中的HPV-DNA，采用碱性磷酸酶标记抗RNA:DNA抗体-化学发光信号显示系统。该方法灵敏度高，还能预测病毒载量，得到世界范围的认可，目前已广泛地应用于宫颈癌的筛查和复查。

3.4基因芯片（genechip）

基因芯片技术是集PCR的基因信号放大技术、倒流杂交及低密度基因芯片法于一身，可具体分型及诊断混合感染，且具有通量大、高敏感性和特异性的特点，可用于细胞学、组织学标本检测，比HC2更适用于流行病学的调查和疫苗方面的研究。其局限性在于操作相对复杂，价格昂贵，不适用于大规模的宫颈癌筛查。

3.5支链DNA（bDNA）技术

bDNA技术检测HPVE6/E7mRNA是基于捕获杂交信号放大技术而研发。该技术原理是“三明治”核酸杂交，能通过信号扩增（而不是核酸序列扩增）提供独一无二的RNA分析和定量检测。RNA可直接从细胞学标本中检测出，无需RNA纯化，无需反转录，无需PCR扩增。因而避免了由于繁琐的流程而导致的被检测项目的失效和变异。HPV感染过程中产生的E6/E7蛋白在宿主细胞中的表达是导致宫颈癌的关键因素。E6、E7蛋白可分别降解并失活宿主细胞抑癌基因p53和pRb，从而造成细胞的恶性转导及肿瘤状态的维持。研究显示，HPVDNA标志物与宫颈鳞癌的形成过程关系较为紧密，而E6/E7mRNA标志物与宫颈鳞癌的发展相关性更高。检测HPVDNA只能反应HPV存在与否，但80%deHR-HPV感染只是“一过性”的，过高的阳性率会增加患者的心理负担及不必要的后续检查及治疗。根据“中心法则”可知，检测信使核糖核酸（mRNA）表达量是实时监测基因转录状态的最好工具。故检测HPVE6/E7mRNA更能反应HPV感染后致癌基因的整合和表达，对于筛查出高级别的宫颈病变有重要意义。更适用于临床疗效对比、疾病的预后判断。

4.小结

综上所述，HPV的持续感染是宫颈癌发病的主要原因，高危型HPV可以通过基因组整合入宿主细胞染色体中引起细胞恶性转化，阻断HPV的持续感染即可阻断宫颈癌的发展进程。用于检测HPV的方法很多，每种检测方法都有其优缺点，根据筛查、科研、随访等目的所选取的方法也有所不同。研究显示，宫颈癌筛查时，HPVDNA检测结果为阴性时排除疾患的价值更高，而mRNA检测结果为阳性时预测疾患的价值更好。评价一个好的筛查方法，应该既不遗漏真正患病的患者，也能较好地排除非患病人群，不给随访者带来较大的心理负担。就目前来说，HPVDNA检测已非常普及，HPVE6/E7mRNA检测亦日趋成熟，两者结合使用更有利于综合评估发生宫颈病变的风险。相信随着医学事业的不断发展，将会有更便捷、低廉、精准的方法应用于临床及科研。

【参考文献】

[1]OmranOM,AlSheehaM.HumanpapillomavirusearlyproteinsE6(HPV16/18E6)andthecellcyclemarkerp16(INK4a)areusefulprognosticmarkersinuterinecervicalcarcinomasinQassimRegion-SaudiArabia[J].PatholOncolRes,2015,21(1):157-166.

[2]FerlayJ,ShinHR,BrayF,etal.Estimatesofworldwideburdenofcancerin2008:GLOBOAN2008[J].IntJCancer,2010,127(12):2893-2917.

[3]ChristopherP.Crum,KennethR.Lee.回允中译.妇产科诊断病理学[M].北京:北京大学医学出版社,2007:268-356.

[4]PirogEC,KleterB,OlgacS,etal.PrevalenceofhumanpapillomavirusDNAindifferenthistologicalsubtypesofcervicaladenocarcinoma[J].AmJPathol2000;157:1055-1062.