患者血清中HV-RNA的PCR检测及扩增产物的分析研究

患者血清中HV-RNA的PCR检测及扩增产物的分析研究

梁红萍

梁红萍(山西省人民医院030012)

【摘要】目的：探讨肾综合征出血热患者血清中HV-RNA的RT-PCR检测的可行性，以及扩增的部分HV靶基因的测序分析。方法：设计并合成了两套分别互补于HVM基因片段和S基因片段的引物，建立检测肾综合征出血热患者临床血清标本中HV基因的RT-PCR方法，并对扩增的部分HV靶基因进行测序分析和比较。结果：206份HFRS患者血清经RT-PCR扩增后，得到特异性的M和S靶基因片段，对急性期HFRS患者血清经RT-PCR检测，结果显示，S基因片段引物对HV靶基因检出率为60.93%，M基因片段引物检出率为40.63%，S基因片段引物的扩增效果显著优于M基因片段，两者相比具有统计学意义（x2=3.67，P＜0.05）。结论：S基因片段引物的扩增效果优于M基因片段引物。

【关键词】汉坦病毒肾综合征出血热聚合酶链式反应

【中图分类号】R446.11【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2012）27-0135-02

HV-RNAPCRandanalysisofamplificationproductsintheserumofpatients

【Abstract】Objective:ThefeasibilityoftheHV-RNAbyRT-PCRintheserumofhemorrhagicfeverwithrenalsyndrome,andtheamplificationofpartoftheHVtargetgenesequenceanalysis.Methods:TheprimersweredesignedandsynthesizedtwosetsofcomplementaryHVMgenefragmentandtheSgenefragmentsfordetectionofrenalsyndromehemorrhagicfeverpatientsinclinicalserumsamplesHVgenesbyRT-PCR,theamplifiedpartoftheHVtargetgenessequencedandcompared.Results:206patientswithHFRSserumwasamplifiedbyRT-PCR,thespecificityoftheMandSoftargetgenefragmentbyRT-PCRdetectionofacutephaseserumsamplesofpatientswithHFRS,resultsshowedthattheSgenefragmentsoftheprimersofHVtargetgenedetectionrateof6093%oftheMgenefragmentprimers,thedetectionrateof40.63%,SgenefragmentsprimerisbetterthantheMgeneprimers,comparingthetwostatisticallysignificant(P<0.05).Conclusion:SgenefragmentprimersamplifiedbetterthantheMgeneprimers.

【Keywords】HantavirusHFRSPolymerasechainreaction

肾综合征出血热(HFRS)是由布尼亚病毒科汉坦病毒属(Hantaviruses，HV)中的某些病毒引起的急性传染病，该病的传播性极强，死亡率较高。早期诊断及治疗对改善患者临床症状，减少患者死亡率尤为重要[1]。传统的诊断方法主要是应用IgM抗体捕获ELISA(Mac-ELISA)或间接免疫荧光试验(IFAT)；但由于ELISA只能检测到有免疫反应性的细胞因子蛋白的含量，而这并不能完全代表细胞因子的生物活性的水平。因而，目前普遍应用的IFAT方法，但IFAT对于患病少于5d的HFRS患者血清抗HV-IgM抗体的检测的假阴性较高。因而，研究新的方法用以检测HFRS患者血清抗HV-IgM抗体极其必要。近年来，随着医学诊断技术的不断进步，PCR以其特异性好、敏感性强，操作简便等特点[2]，在各种传染性疾病病原体的检测中得到了广泛应用[3]。但RT-PCR技术用于早期诊断的检出率仍不高。为了更好的诊断HV病毒，本研究在采用部分新型试剂和经典RT-PCR方法的基础上，比较了互补于M基因和S基因引物的扩增效果，并对扩增产物进行了直接序列测定和比较。现将其汇报如下。

1临床资料与方法

1.1临床资料

1.1.1标本采集

本研究选取本地区协同医疗机构2010年3月至2011年6月门诊及住院的经临床和IFA明确诊断的肾综合征出血热(HFRS)患者血清共206份。HFRS患者血清采集的时间分别为：病日小于1周64份，病日1～2周63份，病日2～3周48份，病日大于3周以上31份。

1.1.2试验样品

TaqDNA聚合酶购于北京佳兰生物科技有限公司；AMV反转录酶购于上海天鸿生物科技有限公司。

1.1.3试验试剂

TrizolRNA提取试剂盒购自于广州捷倍斯生物科技有限公司，QIAEXPCR产物纯化试剂盒购自于上海天呈科技生物有限公司。

1.1.4引物的设计与合成

参照国内外相关文献，根据SchmaljohnCS等发表的HV76-118株M基因片段和SR-11株S基因片段序列的资料，由中国科学院北京生物研究所合成。

1.2方法

1.2.1提取RNA

采用TRIzol法提取血清中的总RNA[4,5]。

1.2.2反转录与第一次PCR扩增

将全部提取的RNA均用于合成cDNA。在上述EP管中直接加入2.5mmolL-1dNTPAMV酶4URNasin20U反转录引物R20pmol5>Buffer4pL补加DEPC处理水至总体积为20pL。水浴保温2h[6,7]。取反转录产物cDNA10pL作为第一次PCR扩增的模板。进行第二次扩增，共循环35次后72延伸10分钟。

1.2.3套式PCR

将第一次PCR产物取10pL加入Tag酶2pL引物SZ/5和S3/6各10pmol，同时补加去离子水至总体积达20pL。

1.2.4PCR产物鉴定[8]

纯化及测序分析取约10pLPCR产物2gL-1琼脂糖凝胶电泳，以pGEM-7zfhaeI作分子量参照。

1.3统计学分析

采用SPSS11.0统计软件包对数据进行统计学分析，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2结果

2.1206份HFRS患者血清标本的检测分析

206份HFRS患者血清经RT-PCR扩增后，得到特异性的M和S靶基因片段，对急性期HFRS患者的血清标本进行RT-PCR检测，结果显示，S基因片段的引物对HV靶基因的检出率为60.93%，M基因片段的引物检出率为40.63%，S基因片段引物的扩增效果明显优于M基因片段引物，经统计学分析，两者扩增效果相比具有统计学意义（P＜0.05），结果见表1。

表1206份HFRS患者血清标本的检测结果

标本采集时间（w）份数S基因阳性率(%)M基因阳性率（%）

＜1d6439(60.93)26（40.63）

1～2d6321（33.33）14（22.22）

2～3d482（4.17）1（20.83）

＞3d3100

总计206份2066241

2.2HFRS患者扩增产物测序分析

取上述用互补于S基因片段的引物扩增的阳性产物6份，经QIAEXkit纯化后，应用全自动DNA测序仪直接进行靶基因的核苷酸序列测定，并用PC/GENE序列分析软件包中的Alignment和Clustal软件或DNASIS和PROSIS对获得的基因序列进行分析比较。结果表明：从1、65、66、67、68、82号HFRS血清扩增的6条靶基因片段，均与LeeHW教授自韩国黑线姬鼠体内分离的HV原型株76-118的S基因片段有较高的同源性，而与相近型别的HV如汉城病毒(SEOV)或多布拉伐病毒(DOBV)S基因片段的同源性均较低。

3讨论

本研究应用RT-PCR检测收集到的2010年3月至2011年6月经临床和IFA明确诊断肾综合征出血热(HFRS)患者血清HV病素进行检测，研究结果显示，S基因片段引物的扩增效果明显优于M基因片段引物的扩增效果，经统计学分析，两组差异具有统计学意义（P＜0.05）；且结果还显示，HV如汉城病毒(SEOV)或多布拉伐病毒(DOBV)S基因片段的同源性均较低。但RT-PCR仍存在一定的局限性，因而，其仍需要进行改进，以为临床提供更好、更准确的检测结果，为患者的治疗提高有例的理论依据。

参考文献

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