小鼠子宫内膜干细胞损伤修复调控机制的研究

小鼠子宫内膜干细胞损伤修复调控机制的研究

叶国柳靳丽杰王玲玲周玉

（蚌埠医学院第一附属医院妇产科安徽蚌埠233004）

【摘要】目的：本研究组通过对经典Wnt信号通路的干涉，观察其对子宫内膜损伤后修复的影响，探讨小鼠子宫内膜干细胞损伤修复调控机制的研究，为子宫内膜损伤修复障碍及其引发疾病的干细胞治疗方法提供新的研究思路。方法：利用Wnt/β-catenin信号通路转基因报告鼠（BAT-gal小鼠）建立子宫内膜损伤模型，了解Wnt信号分布和表达的变化；westernblot和QPCR等方法检测来证实Wnt信号通路激动剂Wnt-7a和阻断剂SFRP-2后Wnt信号通路的调节变化。通过直接荧光显微镜观察和免疫组化染色后显微镜下观察,证实产后小鼠子宫内膜边缘（SP）群干/祖细胞分离纯化并进行培养后移植到损伤的宫腔内，能在宫腔内存活和迁移并且对损伤内膜组织发挥修复作用。结果：A.通过特殊的X-gal染色确证Wnt/β-catenin信号通路存在于子宫内膜损伤修复中并起着重要作用。证实产后小鼠子宫内膜边缘（SP）群干/祖细胞分离纯化并进行培养后移植到损伤的宫腔内，能在宫腔内存活和迁移并且对损伤内膜组织发挥修复作用。证实Wnt/β-catenin信号通路在（SP）群干/祖细胞修复损伤子宫内膜中的调节作用。结论：Wnt/β-catenin信号通路在（SP）群干/祖细胞修复损伤子宫内膜中的调节作用。

【关键词】子宫内膜干细胞；调控；损伤修复

【中图分类号】R324【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2018）34-0176-02

1.引言

人类子宫内膜是一种高度再生组织，一个生育年龄妇女的子宫内膜要经历超过400个周期以上的增长，分化，和脱落。子宫内膜炎，子宫内膜结核等妇科疾病以及宫腔手术都可能导致子宫内膜损伤，从而引起继发性闭经、不孕、习惯性流产等疾病。近年来宫腔镜的广泛应用使子宫内膜疾病的诊断及疗效更具针对性，但是对于子宫内膜修复障碍的治疗方法仍旧十分有限。近年来，国内外的学者从子宫内膜中分离出基质和上皮两种类型的干细胞，而子宫内膜上皮在月经中脱落后的再生有可能是间充质干细胞增殖分化的结果。总之，子宫内膜干细胞的相关研究，为子宫内膜损伤修复的细胞疗法提供了理论依据，但对于子宫内膜干细胞分化调控机制需要进一步的研究。

2.材料与方法

2.1材料

10～14周龄Wistar雌鼠(220～250g），中国医科大学实验动物中心提供)20只；40mg/kg戊巴比妥(Sigma)；SP免疫组织化学超敏试剂盒、DAB显色剂、多聚赖氨酸（上海生工）；辣根过氧化物酶标记二抗（1:2000稀释），羊抗鼠单克隆抗体Wnt-1（1:100稀释），兔抗鼠单克隆抗体β-Catenin（1:200稀释，碧云天）；PVDF膜（Takara）

2.2方法

2.2.1确证Wnt/β-catenin信号通路存在于子宫内膜损伤修复中并起着重要作用本部分实验中，应用Wnt/β-catenin信号通路转基因报告鼠（BAT-gal小鼠）进行研究，用100°热水导管损伤小鼠Y型子宫一侧宫角，在损伤后6h、8h、7d、14d进行取材制作小鼠子宫内膜损伤模型，与正常小鼠比较通过对子宫内膜进行组织切片及X-gal染色，了解Wnt信号在小鼠子宫内膜的分布和表达的变化。

2.2.2分离纯化小鼠子宫内膜边缘（SP）群干/祖细胞；观察它们移植到小鼠损伤子宫内膜后的存活和迁移。

利用MEF作为饲养层培养EGFP+SP细胞，急性损伤后移植一定量未分化的GFP+小鼠边缘（SP）群干/祖细胞至内膜损伤小鼠宫腔内，14天后取子宫，直接荧光显微镜观察和HE染色后及抗GFP蛋白抗体免疫组化染色后显微镜下观察小鼠边缘（SP）群干/祖细胞的存活和迁徙情况。

2.2.3本部分研究旨在了解Wnt-7a和SFRP-2对小鼠子宫内膜损伤模型中经典Wnt信号通路的关键蛋白和下游靶基因的表达水平的影响。

用westernblot方法检测各组小鼠子宫内膜损伤模型β-catenin、GSK3b、Apc、c-myc的表达水平；采用BCA蛋白测定试剂盒对蛋白进行定量，聚丙烯酰胺SDS凝胶电泳后电转移至PVDF膜，5％脱脂牛奶封闭后加入一抗，4℃摇动过夜，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，加入化学发光剂，X线片显影、定影，用图像分析仪测定各条带的吸光度值作定量分析，同时检测B一肌动蛋白表达，确保各组蛋白上样量相等

2.2.4统计学分析使用SPSS22.0软件进行统计分析，Westernblotting灰度值利用ANOVA法中的多重比较判断组间差异（设定P＜0.05）。

3.结果

3.1Wnt/β-catenin信号通路转基因报告鼠（BAT-gal小鼠）建立小鼠子宫内膜损伤模型；通过特殊的X-gal染色确证Wnt/β-catenin信号通路存在于子宫内膜损伤修复中并起着重要作用。

3.2通过直接荧光显微镜观察和免疫组化染色后显微镜下观察,证实产后小鼠子宫内膜边缘（SP）群干/祖细胞分离纯化并进行培养后移植到损伤的宫腔内，能在宫腔内存活和迁移并且对损伤内膜组织发挥修复作用

图2Wnt-l免疫组织化学检测结果

3.3westernblot和QPCR等方法检测来证实Wnt信号通路激动剂Wnt-7a和阻断剂SFRP-2后Wnt信号通路的调节变化。证实Wnt/β-catenin信号通路在（SP）群干/祖细胞修复损伤子宫内膜中的调节作用。

图3Wnt-1与β-catenin蛋白印迹免疫分析

4.讨论

子宫内膜干/祖细胞再生人类子宫内膜的能力,已在异种移植模型中被证明。把人子宫内膜上皮和间质单细胞悬液移植到免疫功能严重低下，缺乏T，B和NK细胞的NOG小鼠肾包膜下方，产生了包含有子宫内膜和子宫肌层的子宫组织。再生子宫内膜移植到去卵巢NOG小鼠，生成了角蛋白+CD9+腺体结构，CD10+CD13+基质和α-平滑肌细胞（αSMA）阳性的肌样组织。异种移植的子宫内膜随着雌激素和孕激素的周期循环而变化，类似人的月经周期。新鲜分离的SP细胞主要构建血管和迁移ERβ，表达血管内皮细胞（80%）。13%基质和8%腺体分别由移植的SP细胞产生。当移植到免疫功能低下小鼠中，克隆的人子宫内膜上皮细胞和间质SP细胞也产生了子宫内膜组织。这些移植产物免疫组化染色显示基质（波形蛋白+）与上皮（CD9+），但不是内皮细胞（CD31+）。有组织的子宫内膜腺体不容易区分，这可能是由于长期的SP细胞克隆培养。再生的子宫内膜组织没有表达ER，但一些细胞表达PR。这些研究表明，具有干/祖细胞活性的子宫内膜细胞亚群可以在体内产生子宫内膜组织。这些亚群还可能诱发子宫内膜异位病灶的生长。

小鼠是一个公认的研究子宫内膜功能的动物模型。在人类胎儿期子宫腺体发育，但在啮齿类动物中腺体发育在出生后，这对于在子宫内膜腺体发育过程中研究子宫内膜干/祖细胞是一个绝对的优势。几种小鼠模型已经被建立,用来研究子宫内膜再生和类似月经后的子宫内膜修复。Wnt/β-catenin信号通路是调控细胞生长和增殖的关键途径，激活靶基因。该通路的核心是胞质内β-catenin稳定，当β-catenin水平低下时，Wnt通路关闭；反之，Wnt通路开启。人类子宫内膜也特征性表达Wnt信号蛋白，并受雌、孕激素调节，参与子宫内膜的发育、分化和胚胎着床等生理过程。

子宫内膜损伤后干细胞的修复和因损伤或其他严重疾病而切除组织或器官的干细胞替代是众多妇产科及干细胞研究者关注的焦点。目前已经证实成人干细胞存在于子宫内膜并且它们可以在体内重建内膜组织，以及Wnt信号相关分子在子宫内膜生长中起着重要作用等。本研究项目利用Wnt/β-catenin信号通路转基因报告鼠（BAT-gal小鼠）建立子宫内膜损伤模型，了解Wnt信号分布和表达的变化；并把分离纯化小鼠子宫内膜边缘群干/祖细胞移植到损伤的小鼠子宫中,通过对经典Wnt信号通路的干涉，观察其对子宫内膜损伤后修复的影响，探讨Wnt信号在子宫内膜干细胞修复中的作用，为子宫内膜损伤修复障碍及其引发疾病的干细胞治疗方法提供新的研究思路。

【参考文献】

[1]JabbourHN,KellyRW,FraserHM,CritchleyHOD.Endocrineregulationofmenstruation.EndocrineRev2016;27:17-46.

[2]GargettCE.Uterinestemcells:whatistheevidence?HumReprodUpdate2017;13:87-101.

[3]GargettCE,ChanRW,SchwabKE.Hormoneandgrowthfactorsignalinginendometrialrenewal:roleofstem/progenitorcells.MolCellEndocrinol2018;288:22-9.