荧光定量RT-PCR检测流感病毒的应用

荧光定量RT-PCR检测流感病毒的应用

严艳红

（南县疾病预防控制中心微生物检验室湖南南县413200）

摘要：随着时代的进步，社会的发展，大多数疾病已经可以得到很好的治愈，但是大规模的流感病毒的爆发，仍然困扰着我们，特别是甲型H1N1流感。流感病毒传染性强，变异性强传播速度快，爆发后难以控制，极大的危害了社会的安定和谐，，影响了人们的生活质量。所以及早点了检测发现流感病毒是抑制病毒传播，控制流感病毒爆发程度的最为关键的步骤。现在国内外常用的检测流感病毒的方法主要有：血清学检测、核酸扩增法检测、细胞培养法、流感病毒抗原检测法等。但是这些常用的方法耗费大量时间和精力，不适用于流感病毒的快速检查。相反，荧光定量RT-PCR是各种检测方法中最灵敏、最有效、最准确的。所以对于荧光定量RT-PCR检测流感病毒的应用的研究是有很大医学价值。

关键词：荧光定量RT-PCR、检测、流感病毒、应用

1.引言

为了使荧光定量RT-PCR对于流感病毒的检测结果更为准确，我们需要运用两组探针同时对流感病毒进行检测，优化PCR检测系统，实现双重保障。在流感病毒爆发时可大量使用来快速检测流感病毒，控制其传播。同时为了方便使用，已经将荧光PCR技术做成了可以方便快速检测流感病毒的试剂盒，经大量实验研究证实，此试剂盒效果优良，适合社会的多种需求。

2.概述

2.1流感及流感病毒概述

流感病毒是流行性感冒病毒的简称。近几年，流感病毒主要被分为甲、乙、丙、丁（A、B、C、D）四型，其中丁型流感病毒主要指的是牛流感病毒。流感病毒的致病范围广，致病性强，可导致人、鸡、鸭、鹅、狗、猪、牛、羊等多种动物及人类的发病，是各种人流感、猪流感、禽流感、牛流感的致病原。人类的流感主要是甲型流感病毒和乙型流感病毒，其中甲型流感病毒的变异型强，且变异快，已经变异出了H1N1、H7N9、H3N2、H5N1等多种病毒亚型，流感病毒的变异仍未停止。主要临床症状为全身肌肉酸痛、全身高人乏力、急性呼吸系统疾病等。传染源为鸡、鸭、鹅等禽类，猪、牛、羊等畜类和人与人之间的相互传染。传播途径主要为人与人接触时的飞沫传播，还有易感人群与病毒携带者及其物品的接触。秋季为流感多发季节，在流感病毒的互相传播中，人流感与禽流感并不能互相传染，而猪则既可以感染猪流感，又可以感染禽流感和人流感。但是也有例外，极个别的禽流感病毒在经过多次变异后，仍然可以造成人类流感的大爆发。

自20世纪以来，甲型流感病毒在全世界范围内多次爆发，1957年在亚洲爆发了H1N1流感，当年下旬在中国被初次发现，并迅速席卷南半球、北美直至全世界，全球约有100万人在此次流感大流行中丧生。流感共延续了三个流感季，总体来讲，老年人的死亡率相对较高，60%以上的死亡者年龄在65岁以上。

2.2荧光定量RT-PCR概述

由于传统的流感病毒检测方法不仅在转移过程中易污染，造成假阳性的出现，而且耗时耗力，已经不适用于流感病毒大爆发时的检测。荧光定量PCR是将荧光标记技术应用于常规多聚酶链式反应仪中，将荧光基团添加到多聚酶链式反应体系中，利用荧光基团来标记，实现检测PCR反应全过程的要求，并通过标准曲线来定量分析待测样本的基因型，做到快速准确检测的可能。荧光定量PCR检测的应用实现了实时监控的要求，解决了传统检测方法只能得出最终结果，不能监控具体过程的困境，该方法可以实时监控每一个扩增步骤，同时将结果记录并存储到计算机中进行精密计算，以此来提高检测的精确率。

3.荧光定量RT-PCR在检测流感上的优点及应用

3.1荧光定量RT-PCR检测的优点

荧光定量RT-PCR技术与常规PCR相比，不仅从定性检测飞跃到了定量检测，而且具有以下几个突出特点。一是避免了转移中的污染问题：由于此试剂是放在密闭的容器内，有单独的试剂盒，无需打开，避免了外界的污染。二是特异性强：利用特异性探针，以引物为模版扩增，进行基因片段特异性扩增。三是便于操作：所有的反应、计算及结果分析都是由计算机自主完成。四是检测速度快：由于整个反应过程都在同一个试剂盒里进行，反应快速，适用于流感病毒大爆发时的快速检测。五是PCR的实时定量检测：传统检测方法只能得出最终结果，不能监控具体过程的困境，该方法可以实时监控每一个扩增步骤，同时将结果记录并存储到计算机中进行精密计算，以此来提高检测的精确率。六是定量分析：根据数据之间的线性关系和标准曲线可以计算出样本量。由于荧光定量PCR的以上优先，如今已经在医学基因工程、植物和微生物等实验研究中大量应用。

3.2荧光定量RT-PCR在检测流感病毒上的应用

实时荧光定量RT-PCR技术不仅可以如传统的检测方法一样定性测定，而且可以定量分析出病毒的DNA分子量，为医学实验研究提供了重要技术支持。目前此技术已经应用到了多种传染病及流行病病原菌的检测中，如甲型及丙型肝炎病毒DNA、HIV及人乳头瘤病毒DNA，更重要的是，该项技术可以对流感病毒分型及其亚型进行检测，并大大缩短了传统方法所需要的检查时间，2004年赖平安等人制作出的荧光定量RT-PCR试剂盒可以快速检测出高致病性禽流感H5亚型，将检测禽流感病毒的时间从原来的21天缩短到了4小时，实现了流感病毒从大量爆发前到爆发开始时的快速检测并控制。除了RT-PCR之外，近几年传统的PCR技术还与ELISA等技术结合发展出了PCR-ELISA等新型检测方法，在各领域的研究中都发挥了关键作用。

荧光定量RT-PCR最重要的应用就是在医学检验中对于传染性疾病和感染性疾病的的及时快速检测。此技术具有高度敏感性，仅有一个病原体就能进行基因扩增检测出病原菌。相比之下传统的病原体抗原检测方法需要上百个才可以检测到。此技术的另一个优点是具有高度特异性，既可以判断显性感染的流感病毒，又可以检测出疾病的隐形状态，解决了免疫学检测常常面临的“窗口期”问题，降低漏诊率。荧光定量RT-PCR技术的多重优点，使其已成为很多实验研究必不可少的技术。以甲型H1N1流感病毒体外转录RNA作为模板，应用荧光定量RT-PCR技术进行检验，可检出10copies/微升体外转录RNA。

4.结论及展望

墨西哥大规模的爆发过甲型H1N1流感疫情，蔓延速度极快，也有个别病例流入我国，导致我国的感染病例增长迅速，严重影响了社会的安定和谐，给群众造成了恐慌。但是应用荧光定量RT-PCR来快速检测甲型H1N1流感病毒可以快速筛查感染人群，达到早发现、早诊断、早治疗的目的，快速控制疫情。随着时代的进步，科学技术的发展，荧光定量RT-PCR技术将会应用到各种流感病毒及其他病原菌的检测中，为人类社会的进步做出巨大的贡献。

参考文献

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[3]邓少丽，罗阳，陈伟.荧光定量PCR技术及其在临床上的应用[J].国外医学临床生物化学与检验学分册，2002，23（5）：301-303