HPLC法测定人尿样中内源性6β-羟基氢化可的松和氢化可的松色谱条件优化

HPLC法测定人尿样中内源性6β-羟基氢化可的松和氢化可的松色谱条件优化

陈瑶万隽张晓光

陈瑶万隽张晓光(厦门市妇幼保健院药学部361003)

【中图分类号】R764.9【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2012）13-0290-03

【摘要】解析高效液相色谱法分离人尿样中内源性6β-羟基氢化可的松和氢化可的松4种不同色谱方案，研究改进思路，建立最佳分离色谱分离条件。

【关键词】6β-羟基氢化可的松氢化可的松高效液相色谱法尿液

药物代谢的主要场所是肝脏，肝脏进行生物转化则依赖于肝微粒体中的多种酶系，其中最重要的是细胞色素以P4503A（CYP3A），该酶系基因的多态性对药物代谢的影响已得到证实[1][2]。为了使患者获得最佳治疗效果，真正达到“用药个体化”的目的，需要侧定CYP3A的活性[3][4]。氢化可的松是内源性的糖皮质激素,体内经CYP3A4代谢为6β-羟基氢化可的松,人尿中6β-羟基氢化可的松和氢化可的松比值可作为理想的体内非损伤CYP3A酶探针，用以评价其活性。采用高效液相法侧定尿液中尿样中内源性6β-羟基氢化可的松和氢化可的松的含量，是目前较常用的一种方法[5]。但尿液中含有多种内生物质，给6β-羟基氢化可的松和氢化可的松的分离带来一定困难。通过对尿样采取液夜萃取的方法提纯浓缩，减少杂质干扰；通过改变色谱条件，提高两种待测物质分离度。现将研究过程中所制定的各种色谱方案、改进思路做一简介。

1材料及样品处理

1.1材料HP1100系列高效液相色谱仪；InsertilODS-3250×4.6mm5um、DiamonsilC18(2)250×4.6mm5um色谱柱；电子分析天平（瑞士METTLERTOLEDO）；高速离心机(湖南湘仪)；漩涡混合器（海门麒麟）；氢化可的松(批号81K1132)、6β-羟基氢化可的松(批号71K1296)均为Sigma公司产品；甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

【基金项目】厦门市科学技术局（3502Z20094018）资助

【作者简介】陈瑶（1967-），女，主任药师，教授。主要从事临床药学研究。Tel:0592-2662059

1.2样品处理取冻存尿样于40℃温水浴中解冻，5mL尿样10000rmin-1离心10min，取3mL尿液加入试管中，加入3mL醋酸乙酯提取液，漩涡提取3min。去水相，取有机相2mL在45～50℃水浴中以氮气流浓缩蒸干。残渣用100μL甲醇溶解，振荡混匀，取20μL进样。

2色谱方案解析

2.1方案1

2.1.1色谱条件

表1梯度洗脱程序表

Tab1Programofflow-rategradientelution

时间/min流动相/%

Water（%）ACN(%)

07822

87822

96040

306040

流速：1ml/min柱温：30℃

检测波长：UV240nm色谱柱：InsertilODS-3250×4.6mm5um

2.1.2测定图谱

图1：尿样与标准品色谱图对比

2.1.3结果分析

通过一次测定，可以同时检测尿样中内源性6β-羟基氢化可的松和氢化可的松两种物质，两者保留时间按分别为5.6min，15.3min并；能将检测时间控制在20min之内，有利于大样本检测。

6β-羟基氢化可的松因极性较强，出峰时间较早，易受尿样中其他极性强的杂质干扰，虽能分离出6β-羟基氢化可的松峰，但该峰受前一杂质峰干扰，未能完全分离；氢化可的松因极性较弱，出峰较晚，保留时间在14min左右，该时段杂质峰较少，对氢化可的松峰影响不大。因此，改进方案的重点在于如何提高6β-羟基氢化可的松的分离度，避免受其他杂质峰影响。

2.1.4改进思路

通过改变流动相配比对标准品进行测定，发现将流动相乙腈比例提高到20%，6β-羟基氢化可的松保留时间可由的5.6min推迟到6.6min，而对氢化可的松保留时间影响不大；如果将乙腈比例加大到22%，其保留时间改变为9min，而氢化可的松的保留时间将推迟至25min之后，将使单份样品时间测定过长，不利于大样本测定工作的开展。因此，通过适当提高乙腈比例，使得6β-羟基氢化可的松峰能够与前杂质峰分离，又不会对氢化可的松出峰时间影响太大。

2.2方案2

2.2.1色谱条件

流动相配比

时间/min流动相/%

Water（%）ACN(%)

08020

88020

96040

306040

流速：1ml/min柱温：30℃

检测波长：UV240nm色谱柱：InsertilODS-3250×4.6mm5um

2.2.2测定图谱

图2：尿样与标准品色谱图对比

2.2.3结果分析

存在问题

如图2所示，尿样中氢化可的松峰明显，但6β-羟基氢化可的松未能得到良好分离。而据文献报道，尿样中内源性6β-羟基氢化可的松：氢化可的松比值约在2:1-4:1范围内，图3尿样色谱图中所示未必是6β-羟基氢化可的松峰。改变流动相配比，同样也影响尿样中其他杂质的出峰时间，干扰6β-羟基氢化可的松的分离。同时，通过多次测定，我们也发现方案2的重现性不如方案1。

改进思路

尿样中含有多种物质，虽经提取法对尿样进行提纯浓缩，但在检测过程中待测物质仍会受到多种杂质的影响。之前考虑的方案均是在固定流动相比例的基础上，通过调整两者流动相的配比来影响待测物质的分离。但是，调整配比会对尿样中所有物质的出峰时间造成影响，影响物质之间的分离度，牵一发而动全身。

通过查阅文献和相关书籍，我们决定使用梯度洗脱的方法改善待测物质的保留时间，提高分离度。梯度洗脱能够避免检测过程中因突然改变流动相配比造成的基线明显漂移。通过梯度洗脱的设置，使得流动相配比在一定时间内匀速变化，降低基线落差，维持基线平稳。通过色谱图我们可以了解到，尿样中多数物质都集中在前10min内出峰。因此，我们考虑在检测过程前10min内设置为梯度洗脱，匀速改变流动相配比，不断改变流动相的极性，提高尿样中各种物质的分离度。同时，长时间的梯度洗脱也能够减小基线漂移。

2.3方案3

2.3.1色谱条件

流动相配比

时间/min流动相/%

Water（%）ACN(%)

09010

106040

256040

309010

流速：1ml/min柱温：30℃

检测波长：UV240nm色谱柱：InsertilODS-3250×4.6mm5um

2.3.2测定图谱

图3：尿样与标准品色谱图对比

图4：方案1与方案3测定色谱图对比

2.3.3结果分析

方案特点

6β-羟基氢化可的松分离度好，峰形尖锐，如图3；相比固定流动相洗脱，梯度洗脱法尿样中各成分分离度得到有效改善，如图4；能将检测时间控制在20min之内，有利于大样本检测，6β-羟基氢化可的松和氢化可的松两者保留时间按分别为9.3min，14.8min；重现性良好。

3.3.4存在问题

基线存在一定程度漂移，如图4所示，大约在10min之后基线略有上漂，但不影响待测物质的测定。

2.4方案4

2.4.1色谱条件

流动相配比

时间/min流动相/%

Water（%）ACN(%)

08515

106040

10.106040

309010

30.108515

408515

流速：1.2ml/min柱温：30℃

检测波长：UV245nm色谱柱：DiamonsilC18(2)250×4.6mm5um

2.4.2测定图谱

图5：尿样色谱图

2.4.3结果分析

方案特点

待测物质分离度好，峰形尖锐，如图5，6β-羟基氢化可的松和氢化可的松两者保留时间按分别为7.0min，25.5min；能够通过固定流动相比例洗脱达到分离目的，避免出现基线明显漂移；重现性良好。

存在问题

测定时间长，完成一次测定需30min。

3总结

我们通过前期的研究，结合高效液相色谱分离理论及文献参考，对方案1及方案2进行改进，最终获得方案3。实际检测结果显示方案3的检测结果令人满意，能够在较短的检测时间内有效分离出6β-羟基氢化可的松和氢化可的松两者待测物质，为今后大样本测定工作创造有利的条件。同样，方案4也值得参考，该方案的显著优势在于能够利用固定流动相配比分离出待测物质，并能够维持基线平稳。缺陷在于检测时间偏长，不利于大样本测定。如能结合梯度洗脱，应能有效缩短检测时间。

色谱柱的不同，以及室温、湿度、设备等实验条件的不同均会影响高效液相色谱法的分离效果。因此，对于色谱方案的选择不能简单的复制文献或其他实验室的方案，因根据自身实验条件，通过大量的实验摸索，结合其他实验室的成功经验，才能够探索出适合自身条件的实验方案。

参考文献

[1]黄敏，汪晖，平洁，等.中国大陆汉族人群CYP3A4基因变异分析[J].中国临床药理学与治疗学，2006，11（3）：54.

[2]高玫梅，邓维意，陈盛强，等.人CYP3A4第9外显子基因突变频率的检测[J].中华生物医学工程杂志，2005，11（5）：24.

[3]BakerSD,vanSchaikRH,RivoryLP,etal.Factorsaffectingcy-tochromeP-4503Aactivityincancerpatients[J].ClinCancerRes,2004,10(24):8341.

[4]TanakaT,OkudaT,YamamotoY.CharacterizationoftheCYP3A4activesitebyhomologymodeling[J].ChemPharmBull,2004,52(7):830.

[5]陈娜，姚兵.高效液相梯度洗脱法侧定血清中氢化可的松和可的松的含量[J].徐州医学院学报，2003，23(2):107-110.