EGCG通过NF-kB(p65)途径活化Caspase-3诱导人胃癌细胞凋亡

EGCG通过NF-kB(p65)途径活化Caspase-3诱导人胃癌细胞凋亡

周薇1戴奇刚2邓鑫3

周薇1戴奇刚2邓鑫3

（1广东广州广东药学院附属第二医院510300）

（2广东广州广东药学院附属第一医院510300）

（3广西南宁广西中医学院附属瑞康医院530000）

【摘要】背景与目的：观察表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin-3-gallate,EGCG)对人胃癌BGC823细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用，探讨EGCG通过NF-kB(p65)途径活化Caspase-3诱导移植瘤细胞凋亡作用的分子机制。方法：建立人胃腺癌(BGC823)细胞裸鼠异种移植瘤模型，用不同剂量的EGCG进行治疗，并设对照；采用Westernblot法肿瘤组织的凋亡相关基因NF-kB(p65)、Bcl-2、Bax、Caspase-3的蛋白表达情况。结果：裸鼠异种移植瘤治疗实验结果显示，EGCG对移植瘤生长有明显抑制作用；Westernblot分析表明EGCG能下调NF-kB(p65)蛋白的表达，促使Bax/Bcl-2蛋白表达的比值增高，并且可以促进Caspase-3的活化。结论：EGCG对人胃癌细胞裸鼠移植瘤有明显的抑制作用并能诱导移植瘤细胞凋亡。其机制可能与通过NF-kB(p65)的下调，促使Bax/Bcl-2比值增高，进而导致Caspase-3的活化而诱导细胞发生凋亡相关。

【关键词】胃肿瘤表没食子儿茶素没食子酸酯细胞凋亡移植瘤裸鼠治疗作用

【中图分类号】R965【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2012）08-0121-03

茶多酚是绿茶提取物，其主要有效成分为表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)，EGCG具有抗肿瘤形成作用。表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）能明显抑制肺癌、胃癌、直肠癌、前列腺癌、乳腺癌等癌细胞的生长增殖[1-3]，EGCG是一种具有开发潜力的防癌、抗癌药物。本实验旨在研究EGCG对人胃癌细胞裸鼠移植瘤细胞的凋亡作用，并探讨EGCG诱导移植瘤细胞凋亡作用的分子机制。

1材料和方法

1.1细胞

人胃癌细胞株BGC823购自中国典型培养物保藏中心。培养于含10％小牛血清的RPMI-1640培养基中，在5％CO2的培养箱内培养传代，取对数生长期细胞用于实验。

1.2动物

BALB/c裸鼠32只，购自中科院上海实验动物中心，雄性，3-4周龄，13-15g。动物质量合格证号为SCXK(沪)2008-0005。无特定病原体(SPF)环境下饲养一周后用于实验。

1.3药物和试剂

表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)购自Sigma公司，纯度95％。将其溶于PBS中，过滤除菌后于4℃保存备用。新型重组人肿瘤坏死因子(nrhTNF)购自第四军医大学生物技术中心。

RPMI-1640培养液为Gibco公司产品，新生牛血清购自杭州四季青生物工程公司，Bcl-2、Bax、Caspase-3、NF-kB(p65)抗体为SantaCruz公司产品。

1.4裸鼠异种移植瘤治疗实验

用无菌PBS调整SGC7901细胞浓度为1×107/ml，在裸鼠背部皮下接种SGC7901细胞悬液0.2ml，用游标卡尺测量移植瘤最长径(L)和最短径(W)，按公式V=L×W2×0.52计算瘤体积。待移植瘤体积达100mm3左右时按随机数字法随机分为6组，即Ⅰ组，阴性对照组(生理盐水)；Ⅱ组，阳性对照组(5－氟尿嘧啶20mg/kg)；Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组分别为低、中、高剂量药物组(5、10、20mg/kg)。肿瘤坏死因子组采用瘤内注射给药，其余组经腹腔注射给药，隔日给药一次，共计10次，给药期间每5日测量鼠体重及移植瘤体积。末次给药48h后用眼球采血法处死裸鼠，切除移植瘤，称取瘤重。

1.5观察指标

1.5.1一般观察指标观察裸鼠的一般情况、体重，测量移植瘤体积，处死后测量移植瘤重量。根据测量肿瘤体积的变化描绘各组的肿瘤生长曲线；根据肿瘤体积计算肿瘤生长抑制率，计算瘤重抑瘤率：瘤重抑瘤率＝(1－处理组瘤重/对照组瘤重)×100%。

1.5.2Westernblot分析Westernblot检测移植瘤组织

Caspase-3、NF-kB、Bcl-2和Bax蛋白表达；观察治疗组与对照组移植瘤中四种蛋白的表达改变情况。于-80℃冰箱中称取组织0.2g，以预冷的PBS洗3次并用眼科剪将组织剪碎于EP管中，将组织转入匀浆器，再加入适量的组织裂解液(100mMNacl、10mMTris-HclPH7.6、1mMEDTAPH8.0、1μg.ml-1Aprotinin、100μg.ml-1PMSF)于4℃研磨，裂解30min，12000r/min离心10min，吸出上清液，即为组织总蛋白，用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。调节每份样品浓度，以等量的蛋白量加样，样品加入1∶1的2×SDS加样缓冲液，沸水煮沸10min，经SDS-PAGE胶电泳后转膜，膜用TBST(Tris-HCL20mmol.L-1,Nacl137mmol.L-1含1%Tween20)配置的5%的脱脂牛奶封闭2h，加入一抗(用封闭液稀(,)释)，4℃孵育过夜；TBST洗3次，每次15min；加相应的二抗(用封闭液稀释)室温孵育1h，TBST洗3次，每次15min；用ECL发光法检测不同样品各种蛋白表达状况，薄层扫描仪(日本产，型号CS-930)测定印迹区带的光密度值。

1.6统计学处理

采用SPSS11.5统计学软件进行数据处理，数据比较采用t检验，率的比较采用的是χ2检验，确定P＜0.05为差异有显著性。

2结果

2.1EGCG对裸鼠及裸鼠移植瘤的影响

整个实验过程中裸鼠饮水、进食正常，均无腹泻、活动迟缓等不良反应，无一裸鼠自然死亡。实验期间各处理组的裸鼠体重均有增加，且与NS对照组相比无显著性差异，提示EGCG无明显毒副作用。EGCG各处理组的瘤重与NS对照组相比差异均有显著性(P<0.05)，低、中、高浓度EGCG组抑瘤率分别为37.25%、42.66%、51.38%，见Tab1。

2.2裸鼠移植瘤的生长情况

实验裸鼠均在接种后7天成瘤，接种后10天肿瘤均长至100mm3左右。裸鼠皮下移植瘤边界清楚，似有包膜，肿瘤表面凹凸不平，呈多个结节状，见Fig1。

2.3EGCG对移植瘤组织中NF-kB(p65)蛋白表达的影响

Westernblot法分析检测移植瘤组织中NF-kB(p65)蛋白表达情况（实验重复3次），EGCG三个浓度处理组NF-kB(p65)蛋白表达均较TNF对照组有下降，5mg.kg-1、10mg.kg-1、20mg.kg-1EGCG处理组与TNF对照组比较时分别比TNF组减少了13%、21%和27%；20mg.kg-1EGCG处理组与TNF对照组比较差异均有显著性(P<0.05)。

2.4EGCG对移植瘤组织中Bcl-2和Bax蛋白表达的影响

Westernblot法分析检测五组移植瘤组织中Bcl-2和Bax蛋白表达情况（实验重复3次）。EGCG三个浓度处理组Bcl-2蛋白表达均较S对照组有下降，其中10mg㎏kg-1、20mg㎏kg-1EGCG处理组与NS对照组比较差异明显，分别比NS组减少了18%和28%(P<0.05)。在对EGCG处理后移植瘤Bax蛋白检测中发现，EGCG10、20mg㎏kg-1组移植瘤细胞中Bax蛋白表达明显增加，其上调的程度分别比生理盐水组升高了16%和25%，差异有显著性意义(P<0.05)。而EGCG5mg㎏kg-1处理组仅比生理盐水处理组高7%，无显著差异（P>0.05）。

2.5EGCG对移植瘤组织中Caspase-3蛋白表达的影响

Westernblot法分析检测四组移植瘤组织中Caspase-3蛋白表达情况。EGCG20mg.kg-1处理组与EGCG5mg.kg-1处理组相比：Caspase-3酶原蛋白条带变细并且可见到蛋白裂解产物，表明EGCG能促进procaspase-3的活化。

3讨论

肿瘤的发生、发展与细胞凋亡异常有极密切的关系，细胞凋亡在肿瘤的发生中具有重要意义。抗肿瘤药物主要通过诱导细胞凋亡发挥作用，能否诱导细胞凋亡及诱导凋亡的程度成为评价抗肿瘤药物的重要指标。

本实验通过裸鼠体内抑瘤实验发现，将EGCG腹腔注射于荷人胃癌细胞移植瘤裸鼠后，可明显抑制移植瘤的生长。其表现为：EGCG处理组移植瘤生长速度较NS对照组明显减慢；与NS对照组相比，EGCG处理组的移植瘤体积、重量均明显下降，且随着EGCG浓度的升高，抑瘤效应加大。

EGCG诱导肿瘤细胞凋亡的复杂的分子机制现逐步得到阐述，近来文献认为其诱导凋亡可能与抑制核转录因子NF-kB活化，导致Bcl-2家族中Bax/Bcl-2的比值的上调，从而促使Caspase-3的活化有关[4-6]。NF-kB在细胞胞浆内是以无活性形式存在，通过I-kB激酶(I㎏K)激活后，受抑制的NF-kB得以释放，发生核移位，在核内积累并与特异性的㎏B序列相结合启动转录。核转录因子NF-kB的下调，可促使与抗凋亡相关的NF-kB靶基因如TNF受体相关因子1等表达减弱，从而促进凋亡。NF-kB还控制Bcl-2家族中两个抗凋亡蛋白：Bfl-1/A1、Bcl-X1的表达，也诱导Bcl-2和抑制Bax基因表达。本实验用Westernblot法检测裸鼠移植瘤组织中NF-kB（p65）蛋白的表达发现：EGCG三个浓度处理组NF-kB(p65)蛋白表达均较TNF对照组有下降，5mg.kg-1、10mg.kg-1、20mg.kg-1EGCG处理组与TNF对照组比较时分别比TNF组减少了13%、21%和27%。

细胞是否进入凋亡途径，细胞中Bcl-Xl或Bcl-2与Bax的比例扮演着重要角色。Bcl-2家族成员在凋亡途径中可能的作用机制有：Bax可以破坏线粒体膜，引起细胞色素c的释放，从而激活cytc/Apaf1(凋亡酶激活因子-1)/Caspase-9信号通路导致细胞凋亡[7]，而Bcl-2的作用正好相反[8]；抗凋亡蛋白如Bcl-2、Bcl-Xl与Bax或Bak相互作用后可阻止Bax或Bak发生构象改变抑或阻止它们的寡聚化作用抑或阻止它们插入线粒体外膜，从而抑制细胞凋亡[9]。裸鼠移植瘤模型中，将富含EGCG的绿茶多酚加至裸鼠的饮用水中，其抑制移植瘤的生长与Bax/Bcl-2的比值的上调、Caspase-3的活化相关。本实验Westernblot结果表明EGCG三个浓度处理移植瘤细胞后Bax/Bcl-2比值都有增加。

药物通过Caspase-3途径诱导肿瘤细胞凋亡时，一方面是促进Caspase-3蛋白的表达，另一方面是促进Caspase-3的活化。在正常情况下，Caspase-3以无活性的Caspase-3酶原形式存在，在各种诱因作用下，被切割而激活。活化后的Caspase-3具有在天冬氨酸残基后切断肽键的能力，可使细胞质，细胞核，细胞骨架的重要蛋白质降解失活，是执行哺乳动物细胞凋亡的最关键的酶，也是引发凋亡的蛋白酶级联反应中的核心蛋白酶[10]。本实验用Westernblot法分析移植瘤组织中Caspase-3蛋白表达情况显示：EGCG20mg.kg-1处理组与EGCG5mg.kg-1处理组相比，Caspase-3酶原蛋白条带变细并且可见到蛋白裂解产物，表明EGCG能促进procaspase-3的活化。

综上所述，EGCG可抑制人胃癌细胞裸鼠移植瘤的生长并能诱导移植瘤细胞的凋亡；其诱导凋亡的作用机制可能与EGCG抑制核转录因子NF-kB活化，导致Bax/Bcl-2的比值的上调，从而促使Caspase-3的活化相关。本实验在EGCG体外抑制肿瘤细胞增殖的基础上，进一步证实了EGCG的抗肿瘤作用，为EGCG应用于肿瘤治疗提供了更完善的理论依据。

图1裸鼠移植瘤的形态学改变

Fig.1Themainmorphologyofxenografttumor

参考文献

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表1各组裸鼠药物治疗后体重和移植瘤重量变化情况

Tab.1ThechangesoftheweightofnudemiceandtheweightofxenograftafterEGCGtreatmentineverygroups(x-±s.n=5)