单链探针反向杂交试验技术检测结核分支杆菌链霉素耐药基因

单链探针反向杂交试验技术检测结核分支杆菌链霉素耐药基因

祝纪华1刘渠2徐亚军2刘衡川3

（1四川省夹江县疾病预防控制中心614100；2广东省深圳市龙岗区疾病预防控制中心518172）

（3四川大学华西公共卫生学院医学检验教研室四川成都610041）

【中图分类号】R915【文献标识码】A【文章编号】1672-5085(2009)10-0005-02

【摘要】用PCR-LiPA可简便、快速、灵敏、特异地检测出一部分结核分支杆菌链霉素耐药株的rpsl、rrs基因突变，可用于临床结核分支杆菌链霉素耐药性的辅助诊断手段。

【关键词】结核分支杆菌链霉素耐药PCR-LiPArpsL基因rrs基因

【Abstract】PCR-LiPAmightbecomearapid,simple,sensitiveandspecificmethodtodetectrpsl、rrsgenesmutationsinpartofstreptomycin-resistantM.tuberculosis.Itcouldbeusedforclinicaldetectionofdrug-resistanceasanassistanttest.

【Keywords】MycobacteriumtuberculosisStreptomycinDrug-resistancePCR-LiPArpoBkatGrpslrrsembBgene.

链霉素作为结核病的一线用药被广泛应用，近年来，国内外耐链霉素病例也在逐渐增高。

单链探针反向杂交试验(LiPA)技术基于探针杂交原理，设计合成一系列探针，覆盖整个待检基因的突变高发区，在严格条件下与带生物素标记的PCR产物杂交，检测杂交信号，根据不同杂交带谱判定出有无突变及突变的大致位置。本研究用此方法同时检测结核分支杆菌链霉素（SM）耐药相关基因，探讨单链探针反向杂交技术检测结核分支杆菌链霉素耐药性的应用价值。

1材料与方法

1.1临床菌株

结核分支杆菌临床分离株50株。2005年至2006年从深圳市四个区级慢性病防治院采集的痰标本中分离，以改良罗氏培养基纯培养，并进行药敏试验分析其耐药特性。

1.2参考菌株

结核分支杆菌标准株H37Rv（93020）、牛型分支杆菌（93006）、偶发分支杆菌（93323）、蟾分支杆菌（93325）、草分支杆菌（93318）、龟分支杆菌（93326）来源于中国医学细菌保藏中心。

1.3方法

1.3.1引物的设计与合成

根据rpsl、rrs基因序列及待检测的突变位点设计引物。上游引物5’端标记生物素，赛百胜公司合成。

表1PCR-LiPA检测MTB链霉素耐药基因引物

编号名称序列5’到3’片断长度Tm值GC%

1上rrs上游CACTGGGACTGAGATACGGC2058.0℃60.0%

1下rrs下游GACAACGCTCGCACCCTA1861.4℃61.1%

2上rpsl上游GTCGGGACAAGATCAGTAAGGT2258.1℃50.0%

2下rpsl下游CTGCGTATCCAGCGAACC1856.6℃51.1%

1.3.2探针的设计与合成

rpsl基因选择3个最常见的突变：43位AAG→AGG，88位AAG→AGG、ACG。rrs基因选择3个最常见的突变：513位A→C、T，516位C→T。据此设计探针：rpsl－S1（43位野生型）、rpsl－R1a（43AAG→AGG）、rpsl－S2（88位野生型）、rpsl－R2a（88位AAG→AGG）、rpsl－R2b（88位AAG→ACG）；rrs－S1（野生型）、rrs－R1a（513位A→C）、rrs－R1b（513位A→T）、rrs－R1c（516位C→T）。赛百胜公司合成。

1.3.3PCR扩增

两种扩增皆使用降落式循环程序，检测到电泳条带后，用四因素三水平正交试验摸索最佳反应体系。用最佳循环条件和最佳反应体系扩增样品。

1.3.4LiPA

应用1U/μlTDT对3pmol/μl探针在37℃加尾2小时；取0.2μ1加尾探针点膜，60℃固定2小时制备膜芯片；加入预杂交液(4×SSC，5×Denharts，0.1mg/ml小牛胸腺DNA，0.5%SDS)预杂交半个小时，与10μ1生物素标记的PCR扩增产物于66℃杂交60min；用1×SSC-0.1%SDS和0.1×SSC-0.1%SDS洗液在室温下各洗膜5min；1:5000的SA-AP与膜在37℃反应30min，室温洗膜，加入底物NBT/BICP闭光显色30min，根据信号强弱判读结果。

1.4PCR-DS

取50μlPCR扩增产物（用未标记生物素的引物扩增）以及相应上游引物送华大生物有限公司测序。

2结果

2.1传统药敏试验结果

50株菌中共有20株不同程度的耐药，2株耐INH，7株耐RFP，15株耐SM，2株耐EMB。

2.2PCR-LiPA的条件优化

2.2.1优化探针浓度

选择点膜探针终浓度分别为1.5pmol/μl、3.0pmol/μl、6.0pmol/μl，与生物素标记的结核分支杆菌H37Rvrpsl基因扩增产物杂交，同时阴性PCR扩增结果做阴性对照，结果当探针终浓度大于3.0pmo1/μl时杂交效果较好，3.0pmol/μl、6.0pmol/μl无明显差异。选择3.0pmo1/μl探针浓度。

2.2.2优化杂交温度

杂交温度分别为62℃、64℃、66℃、68℃、70℃，同时阴性PCR扩增结果做LiPA阴性对照，结果显示66℃无非特异显色，低于此温度有非特异显色，68℃显色斑点颜色过浅，说明杂交效率不高，选择66℃为rrs、rpsl基因突变检测的杂交温度。

2.2.3优化杂交时间

杂交温度66℃，杂交时间分别为30min、45min、60min、75min、90min，随着杂交时间的增加，显色斑点颜色更深，但在大于60min时，有非特异性杂交斑点，杂交时间选择60min。

2.2.4优化杂交液盐浓度

杂交液的盐浓度和SDS浓度将影响杂交的特异性，杂交液成分5×Denharts，0.1mg/ml小牛胸腺DNA成分不变，选择SSC浓度和SDS浓度：4×SSC、0.3%SDS；4×SSC、0.5%SDS；3×SSC、0.6%SDS，杂交斑点颜色以第二个条件最深。选择4×SSC、0.5%SDS。

2.3PCR-LiPA鉴定50株临床分离株链霉素耐药基因突变结果

15株耐SM菌中6株rpsl基因经PCR-LiPA分析有43位AAG→AGG的突变，1株rpsl基因88位AAG→AGG突变，其他8株没有相应位点的突变。敏感菌株中有1株发现有43位AAG→AGG的突变，其他无突变。50株菌PCR-LiPA均未检测到rrs基因相应位点的突变。

2.4PCR-DR鉴定临床分离株链霉素耐药基因突变结果

rpsl基因选择耐SM菌株、检测发生突变的敏感菌株和其他1株敏感菌株共17株测序，有7株发现43位AAG→AGG突变，1株88位AAG→AGG突变，和LipA结果相同。1株88位AAG→ATG突变，而LiPA法未设计此类型突变探针，故LiPA没能检测出此突变，余下菌株与H37Rv标准菌株序列一致。

rrs基因测序选择耐SM菌15株和1株敏感菌株共16株，PCR-DS结果均与H37Rv标准菌株一致。

2.5各基因PCR-LiPA探针敏感性

纯化的结核分支杆菌H37Rv株提取DNA用光密度法测定浓度为757μg/ml。用双蒸水稀释成100μg/ml，再10倍系列稀释。用各引物进行PCR扩增，10μl扩增产物进行LiPA分析，各基因PCR-LiPA探针敏感性均为10pg。

3讨论

本研究以传统药物敏感性试验结果为金标准，PCR-LiPA试验检测SM耐药灵敏度为47%，特异性为97%，47％的SM耐药菌株的rpsL基因突变，没有发现rrs基因的突变，比文献报道的稍少。耐药菌株突变率不同可能是由于地域不同流行的耐药菌株不同。

影响探针特异性的因素，除探针设计外，LiPA过程很多的因素也有影响。首先是杂交温度的选择。对于没有高度同源的探针，经过Blast分析，具有好的特异性，在杂交温度上要求不高。但是S系列探针和R系列探针用于检测突变，针对同一位点的多个探针只有一个碱基不同，杂交温度要求较高，实验发现2℃的差别就可产生非特异性杂交。通常杂交温度低杂交效率高，但特异性降低，杂交温度高特异性较好，但是杂交斑点显色淡，或者不发生杂交。用寡核苷酸探针杂交，适宜温度较Tm值低5℃。实验发现，比Tm值略低1～5℃可在保证特异性的条件下，有好的杂交结果。第二个因素是杂交体系和洗液的离子强度。盐浓度低杂交率较低，随着盐浓度增加，杂交率也增加，但高浓度的盐使碱基错配的杂交更稳定，当探针同源性比较高时，杂交反应液中的盐浓度和洗液的盐浓度不能过高，要维持一定的量。第三个因素是洗膜温度和洗膜时间，洗膜的作用是洗去游离的探针和非特异杂交的探针，非特异杂交的探针通常Tm值比较低，一般低5～12℃，洗膜温度过高可能洗去特异性杂交，过低不能洗去非特异性杂交，洗膜时间也是如此。但本实验没有发现洗膜温度和时间有大的差异，可能是非特异性杂交较少的原因。

PCR-LiPA有简便、快速、灵敏的优点，也存在一些缺点：受到探针数量的限制，和PCR-DS相比不能检测到所有可能的突变类型，更不能检测到新的突变类型；基因突变和耐药表型并非一一对应，只能作为快速检验的辅助手段；探针间的同源性很高，容易出现非特异杂交，因此需要严格控制各项试验条件，否则易出现非特异杂交。

参考文献

[1]http://www.who.comANTI-TUBERCULOSISDRUGRESISTANCEINTHEWORLD.

[2]张敦熔主编.现代结核病学.北京：人民军医出版社,2000,36-980.