丹参干预CCl4致鼠肝纤维化ILK和α-SMA表达的实验性研究

丹参干预CCl4致鼠肝纤维化ILK和α-SMA表达的实验性研究

李新荣1胡坚方2

李新荣1(通讯作者)胡坚方2

（1广东省中山市南朗医院广东中山528451;2江西省人民医院江西南昌330000）

【中图分类号】R575.2【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2012）27-0047-04

【摘要】目的研究在丹参干预CCl4致大鼠肝纤维化过程中，整合素连接激酶(integrin-linkedkinase,ILK)和α-平滑肌肌动蛋白(α-smoothmuscleactin,α-SMA)在肝组织中的表达，探索丹参防治肝纤维化的作用机制。方法建立CCl4诱导的大鼠肝纤维化模型和丹参干预大鼠肝纤维化模型。各分为２周组12只，４周组12只，６周组12只，８周组12只，设立正常对照组12只。对各组大鼠肝组织进行苏木素-伊红染色、免疫组织化学染色，观察肝组织病理变化及ILK和α-SMA的表达情况。结果免疫组织化学染色显示，ILK和α-SMA主要分布在肝窦周间隙，纤维增生的汇管区，纤维间隔及靠近纤维间隔的肝窦周围细胞,两者的表达几乎在共同区域。ILK在正常肝脏组织中几乎没有表达，α-SMA在正常肝脏组织中有少量阳性细胞表达。注射CCl4诱导后，大鼠肝组织中ILK和α-SMA的表达较正常对照明显增强,且2.4.6.8周肝组织中ILK和α-SMA的表达强度呈明显递增趋势(P<0.05)。在丹参干预大鼠肝纤维化过程中，大鼠肝组织中ILK和α-SMA的有少量表达，较正常对照组有轻度增强，无显著差异，较模型组明显减弱(P<0.05)，且自2周后，各干预组肝组织中ILK和α-SMA的表达强度比较均无显著差异(P>0.05)。肝纤维化模型组中，ILK和α-SMA在组织中的表达逐渐增高,它们之间呈正相关(P<0.01)，也均与肝纤维化程度呈正相关(P<0.01)。在丹参干预组中，各组ILK和α-SMA两者在组织中的表达呈正相关(P<0.01)，也均与肝纤维化程度呈正相关(P<0.01)。结论ILK和α-SMA一样，在大鼠肝纤维化及丹参干预大鼠肝纤维化过程中扮演重要角色，说明ILK可能在肝纤维化过程中以及丹参防治肝纤维化过程中发挥着重要作用，这或许可以为研究丹参防治肝纤维化的作用机制提供新的思路和方法。

【关键词】肝纤维化整合素连接激酶α－平滑肌肌动蛋白丹参

肝纤维化(liverfibrosis,LF)是指肝细胞发生坏死或炎症刺激时，肝脏中胶原蛋白等细胞外基质增生和降解失去平衡，进而导致肝脏内纤维结缔组织异常沉积的病理过程，进展期肝纤维化可导致肝硬化，大量的实验研究和临床实践证明，早期的肝纤维化过程可以逆转，而且是唯一可以逆转的阶段，进一步发展成肝硬化则不可逆[1-3]。丹参具有良好的抗肝纤维化的作用，已被广泛应用于肝病患者的治疗，其抗肝纤维化的作用机制的研究也取得长足的进展，丹参抗肝纤维化的作用机制主要可概括为抑制肝星状细胞活化，干预胞内信号转导、抑制钙超载、抗肝脂质过氧化损伤，改善肝脏微循环，抑制胶原生成，促进病理沉积胶原的降解，促进损伤肝细胞的修复，抑制炎性因子释放等方[4]。但仍有许多工作有待深入，如丹参及化学成分的体内过程、丹参有效成分间的相互配伍关系、有效成分的作用靶点等。肝纤维化改变的核心环节是肝星状细胞(hepaticstellatecell,HSC)的活化和细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)合成增多而降解不足。α-SMA是肝星状细胞重要的功能标志，若肝脏中出现α-SMA阳性细胞，提示肝星状细胞向肌成纤维细胞转化，因此α-SMA可作为肝星状细胞的一个激活标志，表明表达α-SMA的活化的HSC是肝纤维化的发生和发展的关键环节。整合素连接激酶(integrin-linkedkinase,ILK)[5]作为一种丝氨酸—苏氨酸蛋白激酶，在调节细胞黏附、凋亡、铺展、迁移、生长、细胞周期、基质积聚、肿瘤形成及胚胎发育等过程中起重要作用，被认为是依赖整合素的连接细胞外基质和细胞内骨架成分的细胞信号传导的中间桥梁。研究发现ILK的过度表达还可激活T细胞（转录）因子，使纤维连接蛋白(fibronectin,FN)的合成和沉积增加，从而在细胞与细胞外基质的相互作用及后者的沉积过程中发挥重要作用，由此可以设想整合素连接激酶和肝纤维化有着密切的关系，是肝脏纤维化形成过程中起重要作用的信号分子，在肝纤维化发生发展以及抗肝纤维化过程中起着重要作用。本研究通过检测ILK和α-SMA在丹参干预大鼠肝纤维化过程中肝脏组织中的分布特点、表达情况、相互关系，探索丹参防治肝脏纤维化作用机制新的思路和方法。

1材料与方法

1.1材料

SpragueDawley雄性大鼠108只，鼠龄相同，体重200g～250g，江西中医学院实验动物中心提供，合格证号：JZDWNo:2006-059。按常规饲养条件，四氯化碳分析纯为国药集团化学试剂有限公司产品，胡姬花一级压榨花生油，鼠抗鼠ILK单克隆抗体为SantaCruz公司(美国)产品，鼠抗鼠α-平滑肌肌动蛋白单克隆抗体为武汉博士德生物工程有限公司产品，碱性磷酸酶标记的兔抗鼠免疫血清为华美生物工程公司产品。

1.2实验方法

108只SD大鼠随机分为下列各组：正常对照组12只，肝纤维化模型组48只，2周组，4周组，6周组，8周组，丹参干预组48只，2周组，4周组，6周组，8周组，每组均12只。除正常对照组外，所有的动物每周2次腹腔注射40%CCl4中性花生油溶液，每100g注射0.3ml给予40%CCl4中性花生油腹腔注射，首次0.5ml/100g，以后每次0.3ml/100g,每周2次,共8周。丹参干预组在以CCL4注射的同时给予腹腔注射丹参注射液2.20ml/kg.d-1（相当于临床24ml/60kg.d-1），每周两次，共8周。正常对照组给予等量生理盐水腹腔注射，每周2次。自给予CCl4腹腔注射后1周开始，每2周处死1组模型组和丹参干预组SD大鼠，直至第8周组，正常组12只SD大鼠统一于第8周末处死。将处死的大鼠摘除整个肝脏，均在肝左叶相同部位取材，切割成2mm厚，15mm长，5mm宽的组织块，常规制备石蜡切片。对各组大鼠肝组织进行苏木素-伊红染色、免疫组织化学染色，观察肝组织病理变化及ILK和α-SMA的表达情况。

1.3ILK和α-SMA免疫组织化学染色结果判断

在高倍镜下(×400),每张切片随机观察五个高倍视野,每个视野计数至少200个细胞，染色结果结合阳性细胞比例及着色深浅进行半定量分析。结果判定标准：参照文献资料[6]，以细胞膜或胞浆染呈黄色至棕褐色为阳性细胞，无着色为阴性。并根据每张切片阳性细胞比例及着色深浅计分：阳性细胞<5%为0分；5%～10%为1分；11%～50%为2分；>50%以上为3分。着色程度：无着色为0分(阴性)，浅黄色为1分(弱阳性)，棕黄色为2分(阳性)，棕褐色为3分(强阳性)。然后根据二者乘积的积分进行统计分析：0分阴性；1分与2分计为＋；3分与4分计为＋＋；6分与9分＋＋＋。

1.4肝纤维化半定量积分标准

采用王泰龄等[7]改进的Chevallier计分法。

1.5统计学方法

组间及组内两两比较采用t检验，两个分类变量的相关性采用秩和相关进行分析；用统计软件SPSS14.0进行分析，P<0.05认为存在显著，具有统计学意义。

2结果

2.1肝纤维化分级程度及积分

诊断与分型参照2006年中国中西医结合学会肝病专业委员会通过《肝纤维化中西医结合诊疗指南》。0级：正常肝脏，未见肝纤维化；I级：汇管区纤维化扩大，局限窦周及小叶内纤维化，二者均不影响小叶结构的完整性；II：汇管区周围纤维化，纤维间隔形成即桥接纤维化，小叶结构保留；III级：纤维间隔伴小叶结构紊乱，无肝硬化；IV级：早期肝硬化，肝实质广泛破坏，弥漫性纤维增生，被分隔的肝细胞团呈不同程度的再生及假小叶形成。本实验各组大鼠肝纤维化程度及半定量积分观察结果(见表1)。

2.2纤维化程度比较

采用likelihoodratio法的2检验各实验组与正常对照组的肝纤维化程度有显著差别，有统计学意义。模型2周组肝纤维化程度与模型4周组比较x2值为11.461，P值为0.003，差异显著，模型4周组与模型6周组比较x2值为7.828，P值为0.048，差异显著，模型6周组与模型8周组比较x2值为7.058，P值为0.029，均小于0.05，差异显著。干预2周组肝纤维化程度和干预4周组比较x2值为1.838，P值为0.399，干预4周组肝纤维化程度和干预6周组比较x2值为0.627，P值为0.731，干预6周组肝纤维化程度和干预8周组比较x2值为2.093，P值为0.553，均大于0.05，无显著差异,干预2周与模型2周比较x2值为0.404，P值为0.525，大于0.05，无显著差异，干预4周与模型4周比较x2值分别为7.058，P值为0.029，干预组6周与模型组6周比较x2值为11.181，P值为0.011，干预组8周与模型组8周比较x2值分别为12.259，P值为0.007，均小于0.05，差异显著，有统计学意义。

2.3ILK和α-SMA免疫组织化学染色结果及比较

正常肝脏：汇管区动静脉壁和中央静脉壁有少量α-SMA阳性细胞，肝窦壁等其余部位未见阳性表达,未见有ILK表达。模型组肝组织中,α-SMA和ILK阳性表达在统一区域,伴随纤维化程度增高而逐步增高，胞浆呈棕黄色或棕褐色，大量表达于纤维增生的汇管区、中央静脉周围、纤维间隔及靠近纤维间隔的肝窦周围细胞，在炎症细胞浸润区的表达也明显增加，在干预组肝组织中，可见α-SMA和ILK的阳性表达较正常组有轻度增多，较同期模型组明显减少，胞浆呈棕黄色，少见棕褐色，表达于纤维增生的汇管区、中央静脉周围、纤维间隔，和模型组α-SMA表达在相同区域，并且随着实验时间的推移，各干预组α-SMA和ILK阳性表达变化不明显(α-SMA和ILK在各组大鼠中阳性表达的结果见表2及表3)。

采用likelihoodratio法的2检验实验各组与正常对照组的α-SMA阳性表达比较差异显著，有统计学意义。各组两两比较中，模型2周组与模型4周组的α-SMA阳性表达比较x2值为5.268，P值为0.072，大于0.05，无显著差异，模型4周组与模型6周组的α-SMA阳性表达比较x2值为3.941，模型6周组与模型8周组的α-SMA阳性表达比较x2值为4.27，P值均小于0.05，差异显著，有统计学意义；干预组2周与干预组4周的α-SMA阳性表达比较x2值为0.268，干预组4周与干预组6周的α-SMA阳性表达比较x2值为1.674,干预组6周与干预组8周的α-SMA阳性表达比较x2值为0.451，P值均大于0.05，无显著差异；干预组2周与模型组2周比较x2值为2.305，P值为0.316，无显著差异，干预组4周与模型组4周比较x2值为8.073，P值为0.045，干预组6周与模型组6周比较x2值为12.228，P值为0.007，干预组8周与模型组8周比较x2值为10.697，P值为0.013，均小于0.05，差异显著，有统计学意义。

采用likelihoodratio法的2检验实验各组与正常对照组的ILK的阳性表达比较差异显著，有统计学意义。两两比较x2检验各组ILK的阳性表达比较如下，模型2周组与模型4周组ILK的阳性表达比较x2值为8.183，P值为0.017，模型4周组与模型6周组ILK的阳性表达比较x2值为8.328，P值为0.016，模型6周组与模型8周组ILK的阳性表达比较x2值为4.763，P值为0.029，小于0.05，差异显著，干预2周组与干预4周组ILK的阳性表达比较x2值为1.269，P值为0.53，干预4周组与干预6周组ILK的阳性表达比较x2值为2.831，P值为0.418，干预6周组与干预8周组ILK的阳性表达比较x2值为0.68，P值为0.712,P值均大于0.05，无显著差异，干预2周组与模型2周组ILK的阳性表达比较x2值为1.767，P值为0.413，大于0.05，无显著差异，干预4周组与模型4周组ILK的阳性表达比较x2值为8.091，P值为0.044，干预6周组与模型6周组ILK的阳性表达比较x2值为12.482，P值为0.002，干预8周组与模型8周组ILK的阳性表达比较x2值为13.5，P值为0.001，均小于0.05，存在显著差异，具有统计学意义。

2.4相关性分析

ILK与α-SMA的相关性分析及它们分别与肝纤维化程度之间的相关性分析采用秩相关分析。ILK与α-SMA的相关性分析r=1.000，P<0.05，两者之间存在正相关关系；ILK的表达和肝脏纤维化程度相关性分析为r=1.000，P<0.05，呈正相关关系；α-SMA的表达和肝脏纤维化程度相关性分析为r=1.000，P<0.05，呈正相关关系。

3讨论

肝纤维化是肝硬化的早期阶段，是肝硬化形成的必经之路。肝纤维化是ECM生成与降解过程失衡的结果，肝脏合成ECM的主要细胞是被激活的HSC，HSC的激活是肝纤维化发生的中心环节[8]。已公认HSC是纤维化生成的主要细胞来源，抑制其活化是防治肝纤维化的一个重要环节[9]。HSC活化的重要表型特征在于细胞增殖及纤维生成能力增强,抑制HSC活化是丹参抗肝纤维化的重要策略。丹参能抑制体外传代培养HSC的活化标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-smoothmuscleactin,α-SMA)的表达，抑制细胞Ⅰ型胶原生成，抑制HSC增殖和胶原合成与促进HSC凋亡的作用，下调FAK是丹参抑制HSCs增殖及胶原合成的分子机制之一[10,11]。TGF－β1是肝纤维化过程中最重要的细胞因子，丹参酚酸B可抑制TGF－β1诱导的HSC内细胞外信号调节激酶（extracellularsignal-regulatedkinaseERK），进而阻止HSC的活化和增殖。

近年来，随着对ILK分子结构、信号传导途径、生物学功能研究的加深，ILK在纤维化疾病中的作用越来越引起人们的重视，对ILK在纤维化疾病的研究日益深入。细胞外基质主要有FN，胶原蛋白IV等，ILK可特征性地调节FN基质积聚，ILK的过表达增加了FN基质的表达，加强整合素和FN的结合，调节由整合素介导的FN等ECM的聚集[12]，影响组织纤维化进程。有研究表明用四氯化碳诱导肝纤维化的鼠模型中发现ILK的表达增高主要在肝窦周区，而静止的肝星状细胞(HSC)未发现有ILK表达，活化的HSC是肝纤维化时ILK表达的主要来源，而且随着HSC的活化表达也增高[13]。本实验发现，模型组ILK和α-SMA的阳性表达较正常对照组明显增强，且随肝纤维化程度加重而递增，丹参干预组ILK和α-SMA的阳性表达较模型组明显减轻；且自实验2周后，各组ILK和α-SMA的阳性表达无明显差异，均和肝纤维化程度呈正相关，提示ILK和α-SMA一样，在肝纤维化及丹参抗肝纤维化过程中扮演重要角色，和HSC的活化有着紧密的联系，ILK参与了纤维化的形成，也参与了丹参抗肝纤维化的过程，已有实验证明过度表达的ILK可以诱导FN和α-SMA的表达增加及E-钙粘蛋白的表达减少[12]。是丹参通过抑制ILK的表达进而抑制HSC的增殖活化，还是丹参抑制HSC的增殖活化进而减轻ILK的表达，ILK在HSC的增殖活化中起的具体作用是什么，以及ILK在丹参防治肝纤维化过程中的主要作用及机制是什么，目前还不清楚。由于丹参成份较多，以及在丹参干预肝纤维化过程中多环节和多靶点等，相关的研究尚少，许多疑点还有待于进一步深入研究。

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