骨髓间充质干细胞向成骨细胞诱导分化的实验研究

骨髓间充质干细胞向成骨细胞诱导分化的实验研究

龚宗明

龚宗明（江苏省常州市第一人民医院骨1科213003）

【摘要】目的：研究体外培养的骨髓间充质干细胞(MSCs)在特定的条件下诱导分化为成骨细胞。方法：从骨髓血中提取MSCs，在含10%胎牛血清，地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C的条件培养基培养的DMEM培养基中培养，放免法检测骨钙蛋白。比色法检测碱性磷酸酶、vonKossa法钙结节染色。结果：MSCs诱导培养后碱性磷酸酶、钙结节、骨钙蛋白表达明显增强。结论：MSCs在一定条件下能诱导分化为成骨细胞，能作为骨组织工程的种子细胞应用于临床治疗。

【关键词】间质干细胞；成骨细胞；分化

【中图分类号】R285.5【文献标识码】B【文章编号】1008-6455（2010）10-0196-01

成骨细胞的增殖是骨折愈合重要因素，也是造成骨不愈合，延迟愈合的主要原因［1］。现在很多医院对一些病人经皮自体骨髓移植治疗骨不连，并取得较好的临床治疗效果，但对其具体作用机制还不清楚，本论文主要通过体外实验研究骨髓移植治疗骨不连可能的作用机制。

1材料和方法

1.1主要试剂与仪器：DMEM培养基(GIBCO，USA)(每L含10%小牛血清、L-谷氨酰胺0.33mg，青霉素100U、链霉素100U、pH7.4)；胰蛋白酶(MERCK，USA)；二甲基亚砜(DMSO)(Merck，Germany)；6孔细胞培养板（Costar，Denmark）；细胞培养箱(NAPCO，USA)；倒置相差显微镜(OLYMPUS，JAPAN)；流式细胞仪(BD，USA)，激光共聚焦显微镜（Leica,TCS-SP5）。

1.2实验方法

1.2.1骨髓基质干细胞（bonemarrowstemcell,BMSCs）BMSCs的体外培养：自愿捐助骨髓患者局部麻醉后，18号骨穿针于髂结节处穿刺，抽取骨髓5ml，置于肝素化的注射器中。在无菌条件下分离，按Haynesworth方法，加入含有地塞米松(10-8mol/LSigma)、β-磷酸甘油钠（10mmol/L,Sigma）和抗坏血酸(50μmol/L,Sigma)的DMEM成骨条件培养液，制成细胞悬液。按1×106个/cm2有核细胞的密度接种于培养皿中，置于37℃，体积分数为5%的CO2的孵育箱培养。24小时后首次换液，使用DMEM成骨条件培养液继续培养，以后每2d换液一次。细胞生长汇合时，用质量浓度为0.25%胰蛋白酶和质量浓度为0.02%EDTA的混合液消化，进行细胞传代，继续培养扩增至第三代细胞，备用。倒置相差显微镜连续观察体外培养细胞的生长、增殖、基质分泌和细胞形态的变化。

1.2.2VonKossa染色:爬片浸于浓度为2%硝酸银溶液中，紫外线照射10min.蒸馏水充分冲洗后，浸入浓度为5%的硫代硫酸纳水溶液2min,再经充分水洗后，用质量浓度为1%的中性红复染1min，酒精脱水，二甲苯透明，树胶封固。

1.2.3碱性磷酸酶（ALP）含量的检测:细胞培养8d后，在DMEM成骨条件培养液中加入1×10-8mol/L的1、25-OH2VD3，第9天和第18天取上清液，按南京建成生物工程研究所操作说明书操作。

1.2.4骨钙蛋白（OCN）含量的检测：细胞培养8d后，在DMEM成骨条件培养液中加入1×10-8mol/L的1、25-OH2VD3，第9天和第18天取上清液，送江苏省人民医院核医学实验室检测。

2结果

2.1VonKossa染色形态学改变：经各种诱导剂作用后，细胞中出现黑色颗粒的沉积，并随作用时间的延长而增多(图1)。

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VonKossa染色形态学改变2.2不同时间点细胞分泌的碱性磷酸酶测定：加入各种诱导剂后，不同时间取上清液，比色法检测其中碱性磷酸酶含量变化。结果表明：第9天和第18天碱性磷酸酶含量明显增高，并呈时间依赖性(P<0.01)(表1)。

表1不同时间组碱性磷酸酶含量变化

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*与培养第8天相比较*P<0.01

2.2不同时间点细胞分泌的骨钙蛋白（OCN）含量测定：加入各种诱导剂后，不同时间取上清液，比色法检测其中碱性磷酸酶含量变化。结果表明：第9天和第18天骨钙蛋白（OCN）含量明显增高，并呈时间依赖性(P<0.01)(表2)。

表2不同时间组骨钙蛋白含量变化

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与培养第8天相比较*P<0.01

3讨论

种子细胞的来源是组织工程化骨形成的首要因素，骨髓基质干细胞是目前骨组织工程研究的热点。大量实验证明，BMSCs能向成骨细胞转化，具有活跃的成骨能力，可以作为组织工程构建骨组织的种子细胞，同时它易于获取、扩增。

研究表明地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C是MSCs向成骨细胞分化的必要条件[2-3]。地塞米松促进MSCs向成骨细胞分化的同时促进碱性磷酸酶、骨钙素等mRNA的表达；生素C促进MSCs合成胶原。β-甘油磷酸钠在培养液中迅速被碱性磷酸酶水解,产生大量磷酸离子,促进生理性钙盐的沉积和钙化。

碱性磷酸酶是判断成骨细胞分化重要标志酶之一，成骨细胞的分化使得大量碱性磷酸酶释放，从而水解有机磷酸酶，使其释放出无机磷，进而形成羟基磷灰石；骨钙蛋白是判断成骨细胞成熟的主要标志，主要作用是对细胞外基质矿化有重要调节作用。本实验结果显示，MSCs在特定诱导剂作用下，碱性磷酸酶、骨钙蛋白等随着时间的延长而表达增强。表明MSCs能在一定条件下转化为成骨细胞，成为作用种子细胞应用于临床骨科治疗。具体分子诱导作用机制有待于进一步研究。

参考文献

[1]周其佳，部雄虎，孙月柏.经皮自体骨髓移植治疗骨不连.中华创伤骨科杂志，2007，9：95

[2]CoelhoMJ,FernandesMH.Humanbonecellculturesinbiocompatibitytesting.Part2:effectofascorbicacid.β-glycerophosphateanddexamethasoneonostoeblastdifferentiation[J].Biomaterials,2000,21(11):1095-1102

[3]JaiswalN,HaynesworthSE,CaplanAI,etal.Osteogenicdifferentiationofpurified,culture-expandedhumanmesenchymalstemcellsinvitro[J].JCellBiochem,1997,64(2):295-312

[4]HerbertsonA,AubinJE.Cellsortingenrichesosteogenicpopulationsinratbonemarrowstromalcellcultures[J].Bone,1997,21(6):491-500