食品中金黄色葡萄球菌荧光定量PCR快速检测方法的建立

食品中金黄色葡萄球菌荧光定量PCR快速检测方法的建立

潘玉辉李玉蔡秀芝王艳孙婷媛孙宏徐艳霞

潘玉辉李玉蔡秀芝王艳孙婷媛孙宏徐艳霞黑龙江省哈尔滨市疾病预防控制中心细菌检验科黑龙江哈尔滨１５００５６

【摘要】目的:利用荧光定量PCR检测技术,建立由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒的快速检测方法.方法:以金黄色葡萄球菌的特异性DNA核酸片段作为靶序列,采用聚合酶链反应(PCR)结合Taqman技术,以哈尔滨市２０１３~２０１４年度食源性致病菌主动监测分离鉴定的菌株作为阳性菌,对其进行荧光检测.结果:本研究建立的反应体系对１８株金黄色葡萄球菌呈现出良好的扩增曲线,在５株相关细菌的检测中,除金黄色葡萄球菌结果为阳性外,其余菌株均为阴性.结论:该方法特异性强、灵敏度高,操作简便快速,适应于由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒及食源性疾病的快速检测,具有较大的推广及应用价值.

【关键词】金黄色葡萄球菌;快速检测;荧光定量PCR【中图分类号】R１５５【文献标识码】ADOI:１０．１０１６/j．issn．２０９５－８５７８．２０１５．０１．０１０EstablishmentofRealＧtimequantitativePCRMethodforDetectionofStaphylococcusaureusinfoodPanyuＧHui,liyu,caixiuzhi,wangyan,suntingyuan,sunhong,,xuyanxia(HeilongjiangProvince,HarbinCenterforDiseaseControlandPevention,Harbin,１５００５６China)Abstract:Objective:ToestablisharapidsensitiveandspecificdetectionmethodfordiarrheagenicdiseasecausedbystaphylococcusauＧreuswithRealＧtimequantitativePCR．Methods:AsstaphylococcusaureusspecificDNAfragmentasatargetnucleicacidsequence,usingthepolymerasechainreaction(PCR)withTaqmantechnology,detectedpositivestaphylococcusaureusstrainsisolatedfromthe２０１３—２０１４foodbornepathogensmonitoringofHarbinCity．Results:１８strainsofstaphylococcusaureuspresentedagoodamplificationcurve．Inadditiontostaphylococcusaureusstrainsappearedgoodamplificationcurve,theresultwaspositive,theotherfivestrainsallwerenegative．ConcluＧsion:Themethodisspecificity,highsensitivity,handilyandrapid,whichmighthaveadapteddiarrheagenicdiseasecausedbystaphylococＧcusaureusdevelopmentneedandhavegreatpromotionandapplicationvalueinpraticalwork．Keywords:Staphylococcusaureus;Rapiddetection;RealＧtimePCR

金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是一种普遍存在于自然界中的一种重要食源性致病菌之一.在我国,由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒约占细菌性食物中毒的２５％,而在美国、加拿大等国家,更是高达５０％[１－２].因此,食品一旦被金黄色葡萄球菌污染极易引起食源性疾病的暴发流行.金黄色葡萄球菌的检测方法有分离培养法、琼脂扩散法、乳胶凝集法以及血清学、PCR检测方法等,均较费时费力,不能满足快速检测的需要[３].荧光定量PCR技术提供了理想的检测方法.本文旨在建立一种金黄色葡萄球菌的特异、快速的检测方法,并对荧光定量PCR技术与国家标准分离培养方法进行比较,评价其效果,为金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食源性疾病提供了科学依据.

１．材料与方法

１．１仪器设备与试剂７３００型荧光定量PCR仪(美国ABI)公司;金黄色葡萄球菌核酸测定试剂盒(荧光PCR法)(上海之江生物科技有限公司);细菌培养用培养基为北京陆桥生物技术有限公司.

１．２菌种１８株金黄色葡萄球菌阳性菌株为(哈尔滨市２０１３~２０１４年度食源性致病菌主动监测分离鉴定的菌株);大肠埃希氏菌、志贺氏菌、沙门氏菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O１５７:H７等菌株由黑龙江省疾病预防控制中心提供.

１．３模板DNA的制备按试剂盒核酸提取说明书进行.

１．４反应体系与参数反应体系为４０ul;设置循环参数为:３７℃×２min;９４℃×２min;９３℃×１５sec;６０℃×６０sec,循环４０次,单点荧光检测在６０℃.荧光通道检测选择用FAM和HEX通道.

２．结果２．１特异性试验对金黄色葡萄球菌及５种相关细菌进行检测,除金黄色葡萄球菌出现良好的扩增曲线,其它细菌均未出现曲线扩增.说明本方法对金黄色葡萄球菌有很好的特异性,与其它相关细菌无交叉反应(如图１).

３．讨论金黄色葡萄球菌在人和动物中具有较高的带菌率,人的咽喉、鼻腔、皮肤、头发等常带有产肠毒素的菌株,故易于经手或空气污染食品.约３２％的食品中存在金黄色葡萄球菌[４].金黄色葡萄球菌能分泌２０多种毒性蛋白质,其中最主要的一种是葡萄球菌肠毒素,它们是暴发食物中毒的致病因子,占细菌性食物中毒的第２位[５].金黄色葡萄球菌引起的食物中毒严重危害人体健康,多见于春夏季,中毒食品种类多,如乳及乳制品、蛋及蛋制品、给类熟肉及生肉制品等[６].

本研究建立的荧光定量PCR技术经过对１８株金黄色葡萄球菌及５种相关致病菌的检测发现,它不仅特异性高,而且更快速、灵敏,从核酸的提取至完成检测,最快能在３h内完成.适应于由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒及食品安全事故的快速检测,具有较大的推广及应用价值.

参考文献

[１]张文治．新编食品微生物学[M]．北京:中国轻工出版社,１９９５．

[２]彭国华,胡主花,薛琳,等．食物中毒样品中金黄色葡萄球菌及肠毒素检测[J]．现代预防医学,２００８,３５(２０):３９４３－３９４５．

[３]吴斌,秦成,裴轶君,等．食品中金黄色葡萄球菌肠毒素的快速检测方法[J]．微生物学通报,２００４,３１(５):９３－９４．

[４]DingesM,OrwinPM,PatrickM．SchlievertExotoxinsofStaphylococcusaureus[J]．ClinMicrobiolRev,２０００,１３(１):１６－３４．

[５]雷祚荣．葡萄球菌和葡萄球菌毒素病[M]．北京:中国科学技术出版社,１９９２．

[６]王韶,刘桂华,乔风,等．食品中金黄色葡萄球菌的PCR检测[J]．吉林大学学报(医学版),２００６,３２(５):３３９－６３９．