生药寡糖类成分研究及应用

生药寡糖类成分研究及应用

赵吉诺1赵吉思2

赵吉诺1赵吉思2(1黑龙江省中医药大学附属第一医院药剂科150090;2哈市医科大学附属二院药学部150081)

生物体内大多数蛋白质是糖蛋白。糖蛋白中糖寡链影响蛋白质的整体构象，影响蛋白质的折叠、溶解度、半衰期、抗原性及生物活性等，糖链与蛋白质的相互作用介导细胞的专一性识别和调控各种生命过程如：受精、发生、发育、分化、神经系统、免疫系统恒态的维持等，在炎症及自身免疫疾病、老化、癌细胞异常增殖及转移、病原体感染等过程中起重要作用[1]。糖蛋白中寡糖链的结构及作用机制研究已成为生物学基础理论的课题之一[2]。目前已有研究证实，寡糖结构决定了糖蛋白药物的生物活性、药物动力学和药效[3]。寡糖已被普遍视作一种潜在药物，广泛应用于癌症的免疫治疗和预防感染及中和毒素的治疗。

1寡糖的结构

寡糖（oligosaccharide）又称低聚糖，为两个或两个以上（一般指2-10个）分子的单糖以糖苷键缩合形成的糖分子。寡糖可水解成各种单糖，寡糖与多糖之间并没有严格的界限。含有两个单糖单位的寡糖叫双糖，含有三个单糖单位的寡糖叫三糖。寡糖还可以按组成的单糖类型是否相同分为同质寡糖和异质寡糖。按是否存在半缩醛羟基分为还原性寡糖和非还原性寡糖。按是否存在生物学功能分为普通寡糖和功能性寡糖[6]，目前，国际上开发成功的功能性寡糖有70余种[7]，本文所论述寡糖均指功能性寡糖。

2寡糖的提取及分离纯化

寡糖的制备目前主要技术路线为天然产物来源提取法、酶合成法效果较好；化学合成法、发酵法、天然多糖的酸水解法偶有应用[8]。以低聚半乳糖(GOS)为例，向小丽[9]以乙醇水溶液作为提取溶剂从鹰嘴豆中直接提取α-低聚半乳糖(α-GOS)，总α-GOS的含量在6.35％～8.68％；卢丽丽等[8]以从土壤中筛选获得的具有转糖基活性的β-半乳糖苷酶产生菌产生转糖基D一半乳糖苷酶，以乳糖为底物生成低聚半乳糖，产量为40.7%。

由于制备的寡糖杂质较多，常进行进一步分离纯化。目前常用色谱柱分离法、膜分离法；酶法及微生物发酵法较少采用。色谱柱分离法其中离子交换树脂法是分离糖类的常用方法[10]，冯咏梅等[11]采用阳离子交换树脂柱成功分离提纯了低聚半乳糖(GOS)混合物。武卫红[12]采用醇提、乙酸乙酯萃取、大孔树脂吸附后活性炭层析的方法从地黄中分离得到水苏糖粗品，然后用pharmadexG-10层析纯化。

3寡糖的分析鉴定

因为糖在正常的紫外区域和可见光范围内无吸收峰及荧光，故寡糖用检测器通常选择示差折光检测器(RID)，而不是紫外检测器(UV)或荧光检测器(FD)。邱建国等[18]采用NH2-硅胶色谱柱分离,示差折光检测器检测,HPLC法测定地黄寡糖。通过常规的HPLC的光学检测模式直接对糖类物质进行高灵敏度的直接检测比较困难，常通过衍生化将糖类物质转变为具有紫外吸收或可产生荧光的物质,然后进行分离间接检测以克服直接检测方法的缺点，实现高灵敏度检测和痕量分析。红外光谱是糖结构研究重要手段之一，可提供糖类的官能团及氢键的相关信息。质谱(MS)作为检测器或使用核磁共振光谱(NMR)，则成为获取相对分子质量及结构等信息的有力工具。由于寡糖结构复杂，用一种分析方法难以达到良好的分析结果，利用凝胶层陈海敏[23]以琼寡糖为研析柱分离出聚合度在2到10的各种纯寡糖，利用TLC，GC-MS，FT-IR，NMR及MALDI-TOF-MS等工具对降解产物以及纯寡糖进行了结构鉴定。进一步的分离纯化后，进行1H-NMR、13C-NMR和ESI-TOF-MS分析确定其结构组成。Liu等[24]认为HPLC结合ESI-MS可以快速有效的分析鉴定多糖的水解产物以及生物系统所产生的痕量级的寡糖及其同分异构体。高洋等[25]用反相离子对-超高效液相色谱(RPIP-UPLC)和电喷雾离子源-四极杆-飞行时间质谱(ESI-Q-TOF-MS)联用技术快速分离鉴定聚合度为3～45的κ-卡拉胶寡糖，可得到直至27糖的各寡糖结构信息。

4生药中寡糖的药理作用

4.1寡糖影响机体肠道生态和生理的作用

与人体有共生关系的双歧杆菌，其细胞表面具有寡糖的受体，寡糖对双歧杆菌的生产及定值具有重要作用，多种寡糖对双歧杆菌的增殖作用已得以证明[26]。潘晓东[27]研究发现寡糖进入肠道后，能够被共生的微生物选择性地作为碳源，进而可促进肠道有益菌增殖，同时，其还具有抑制肠内病原菌的黏附、增加肠粘膜免疫应答的作用，能够提高小鼠的免疫水平,增加肠内短链脂肪酸(SCFA),优化肠内菌群,增强钙镁铁的吸收,起到改善肠道生理的作用。并在右旋葡聚糖硫酸钠(DSS)急性炎症造模过程中,果寡糖(FOS)、半乳寡糖(GOS)及与嗜酸乳杆菌的混合物的添加能够减轻肠道的损伤,降低疾病活动指数。

4.2寡糖具有抗凝活性

肝素是一种天然酸性糖胺聚糖，显示出优良的抗凝血性。但是长链肝素的分子特异识别性降低，倾向于与其他蛋白质结合，尤其是血小板因子4，由此诱发血小板减少症；肝素也诱发出血症、高血钾症等副作用。鉴于此，一些研究人员用化学方法合成肝素寡糖以调控类肝素的电荷和分子尺度，从而最大程度地避免肝素的副作用，药效满意[28]。但由于肝素高度复杂的结构特征，以及目前还没有很好的生化方法通过控制降解得到结构精确的肝素片断；要想真正解决肝素的构效关系，目前必须通过化学方法合成具有精确结构的化学纯的肝素寡糖序列[29]。目前化学方法合成寡糖存在诸多问题导致尚无工业化生产，因此从自然界生药材中寻找类肝素寡糖衍生物相似结构或其前体不失为一条可行之路。

4.3寡糖具有抗炎活性

寡糖可以抗微生物感染,是一类效果很好的抗生素替代品[30]。胡佩红[31]发现无论是革兰氏阴性还是阳性细菌，褐藻胶寡糖都能有效抑制其生长，表现出广谱抗菌活性。褐藻胶寡糖对建立的以血管通透性为主要改变的两种动物急性炎症模型中炎症均有一定抑制作用。陈海敏[23]证实琼寡糖有着多种活性，聚合度(DP)在2-4的琼寡糖能够抑制炎症因子TNF-α的产生和iNOS的表达，而DP在6-8的寡糖是植物特别是藻类防御体系中重要的激发子。正是由于琼寡糖的这些已知以及未知的活性使它们具备了很大的药用和食用价值。

4.4寡糖具有提高机体免疫功能活性

麻攀等[32]发现壳寡糖能够缓解甲萘醌诱导的巨噬细胞损伤,并且发现壳寡糖可以缓解甲萘醌导致的胞内超氧化物歧化酶(SOD),谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活力的降低,以及抑制相应的脂质过氧化反应产物(MDA)的产生,表明壳寡糖可能通过此机制来抵制甲萘醌导致的氧化损伤。盛荣华等[33]发现牛蒡寡糖能提高小鼠的脾淋巴细胞增殖及IL-2、IFN-γ的分泌。结论为牛蒡寡糖对正常小鼠的免疫功能具有促进作用。

4.5寡糖具有对机体细胞及神经元的保护活性

紫外线广泛存在于自然界中，其引起的过量氧自由基会诱导光老化、癌症及神经退行性疾病的发生和发展，在病理学过程中扮演了重要角色。任舒文发现[34]多糖褐藻胶寡糖、卡拉胶寡糖、琼胶寡糖和壳聚糖寡糖的电荷性质、聚合度以及连接与其上的极性基团，均相应的会对其与鱼皮胶原蛋白活性肽间的作用方式产生不同程度的影响，引起复配物抗紫外活性的不同，其能够定位于线粒体，抑制皮肤细胞的光老化和凋亡，起到抗紫外辐照作用。

4.6寡糖具有抗病毒活性

马悦欣等[38]发现κ-新卡拉寡糖对Vero细胞毒性极低,可干扰标准单纯疱疹病毒1型（HSV-1）毒株向Vero细胞的吸附。提示κ-卡拉胶寡糖可能封闭细胞表面的病毒吸附蛋白受体,或作用于细胞而使细胞处于抗病毒状态。WeinbergerF[39]发现琼胶类硫酸半乳低聚糖对I型和II型单纯疱疹病毒具有选择性的抗病毒活性，这可能是因为此类寡糖干扰了病毒对宿主细胞的最初附着。因此王延鹏等[40]总结认为寡糖的抗病毒机理主要为阻止病毒与细胞表面受体间的黏附和具有酶抑制剂活性。

4.7寡糖具有抗肿瘤活性

官杰等[41]发现壳寡糖协同双歧杆菌可抑制肿瘤生长,同时壳寡糖可能诱导肿瘤细胞凋亡。。陈海敏等[44]利用基因芯片技术和寡糖亲和探针技术从mRNA和蛋白水平证实λ-卡拉胶寡糖和琼胶寡糖二者都能明显抑制膜上血管密度，观察到膜内管腔的减少以及内皮细胞的移行减少且二者均有细胞毒样作用。认为两物质的血管新生抑制作用可用于开发抗肿瘤、抗炎等药物。

寡糖是生命运动中的活性物质，来源十分丰富，但由于常用检测器对其不敏感，导致其在生药研究开发过程中常受到忽视。随着研究的深入，寡糖的多种生物活性已逐渐为人们所知，随着现代分析仪器的不断普及，寡糖的研究、开发与利用必将具有更加广阔的前景。