实时荧光定量PCR在流感病毒核酸检测中的应用

实时荧光定量PCR在流感病毒核酸检测中的应用

蒋永林

蒋永林

湖南省永州市疾病预防控制中心425000

【摘要】目的：探究实时荧光定量PCR技术在流感病毒核酸检测中的应用价值。方法：选取2013年1月至2014年12月在我市采集的流感样病例咽拭子1624例用实时荧光定量PCR检测流感病毒核酸，分析检测的阳性率与阳性病例样本类型，总结流感流行趋势。结果：1624例咽拭子样本中流感病毒核酸呈阳性419例，阳性检出率为25.80%。阳性样本中甲型流感病毒H1N1亚型164例，占39.14%，甲型流感病毒H3亚型176例，占42.0%；乙型流感病毒79例，占18.85%。不同类型的流感病毒阳性检出率差异具有统计学意义（P<0.05）；结论：实时荧光定量PCR技术可迅速、准确的检测流感病毒核酸，有助于分析流感病毒的类型与流行趋势，为预防流感发生提供参考依据。

【关键词】实时荧光定量PCR；流感；病毒核酸；检测

流行性感冒[1-3]（简称流感）是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病，临床表现为起病急、高热、头痛伴有严重不适、干咳、咽喉疼痛等症状。流感潜伏期短，传播迅速，病毒抗原易变异，人群对变异株普遍易感。2009年甲型H1N1流感自墨西哥爆发后迅速蔓延全球，引发了人们对流感的恐慌，同时也引起了人们对预防流感的重视[4]。

为有效预防流感的流行，加强对流感病毒的快速检测能力，本文研究了实时荧光定量PCR技术在流感病毒核酸检测中的应用效果，现将报道如下。

1资料与方法

1.1一般资料

选取2013年1月至2014年12月在我市收集的流感样病例的咽拭子共1624例。所有咽拭子均是擦拭疑似流感患者的双侧咽扁桃体或咽后壁。咽拭子采集后置于含4.0ml的Hank′s液中，暂时于4.0℃冰箱中保存，并于24小时内送至实验室。实验室收到样本后先在旋窝震荡器上震荡5秒钟并取出拭子，编好号后置负70.0℃冰箱中保存。

1.2试剂与设备

核酸提取试剂盒为ViralRNA/DNAMiniKit（美国Invitrogen公司）；荧光定量检测试剂盒为：甲型流感病毒核酸测定试剂盒（荧光PCR法）、乙型流感病毒核酸测定试剂盒（荧光PCR法）、甲型H1N1流感病毒核酸测定试剂盒（荧光PCR法）、甲型流感病毒H3亚型核酸测定试剂盒（荧光PCR法）（上海之江生物科技有限公司）；荧光定量PCR仪（美国AB公司）、低温高速离心机（德国Eppendorf公司）。

1.3研究方法

样本核酸提取按试剂盒ViralRNA/DNAMiniKit说明书进行。PCR检测反应体系总体积为25.0ul：取检测混合液19.0ul，加酶混合液1.0ul（内含逆转录酶和Taq酶），最后加入5.0ul待测样本核酸提取液，震荡混匀并短暂离心后上机检测。PCR反应条件为：45.0℃，10min，95.0℃，15min；95.0℃，15sec，60.0℃，1min，共40个循环，单点荧光检测在60.0℃时进行。

1.4观察指标

统计采用实时荧光定量PCR技术检测流感病毒的阳性率，并分析阳性样本的类型。

1.5统计学方法

采用SPSS18.0统计学分析软件进行数据处理，计数资料采用百分数表示，组间比较采用χ2检验，以P<0.05作为差异具有统计学意义的标准。

2结果

2.1PCR检测结果分析

表1流感病毒核酸PCR检测结果

本研究采集的1624例咽拭子样本经实时荧光定量PCR技术检测后共证实流感病毒核酸呈阳性419例，阳性检出率为25.80%。阳性样本中甲型流感病毒H1N1亚型164例，占39.14%；甲型流感病毒H3亚型176例，占42.0%；乙型流感病毒79例，占18.85%。不同类型的流感病毒阳性检出率差异具有统计学意义（P<0.05）。详见表1。

3讨论

流行性感冒是急性呼吸系统常见疾病，主要是由流感病毒引起的，具有感染性强、潜伏期短、病情发展迅速等特点，患者临床表现多为高热、乏力、呼吸系统疾病症状等，严重威胁人类生命健康[7，8]。相关研究表明[9]，流感病毒致病率高，而且随着药物广泛治疗，病毒的变异性逐渐提高。为了降低发生大范围的流感病毒感染的风险，必须加强对流感病毒的预防[10]。实时荧光PCR检测技术是利用PCR反应体系中加入荧光基因，并利用荧光信号实时积累并监测整个PCR反应进程，最后利用标准曲线对检测目标物进行定量分析，是临床上用于病毒核酸定量检测的常用方法。因此，笔者研究采用实时荧光定量PCR检测流感病毒核酸的应用效果，旨在为临床应用提供参考。

本研究通过对1624例疑似流感患者咽拭子样本进行实时荧光定量PCR技术检测，共检测出甲型流感病毒H1N1亚型164例，占39.14%；甲型流感病毒H3亚型176例，占42.00%；乙型流感病毒79例，占18.85%。研究结果提示实时荧光定量PCR技术对甲型流感病毒H1N1亚型、甲型流感病毒H3亚型的检测阳性率较高。实时荧光定量PCR技术是利用对病毒RNA进行高效的扩增，并利用高敏感的光谱技术和特异性的生物探针技术，特异性的检测流感病毒。该方法具有操作简单、准确、直观等优势。

综上所述，采用实时荧光定量PCR技术应用于流感病毒核酸的检测具有快速、准确、直观等优势，有助于分析流感病毒的流行类型及趋势，为预防流感发生提供参考。

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