外周血染色体制片成功方法的探讨

外周血染色体制片成功方法的探讨

胡惠彬

永州市妇幼保健院湖南永州425000

【摘要】目的探讨外周染色体制片成功的方法。方法将2014年3月至2016年3月来我院进行遗传咨询以及治疗的500名人员作为研究的对象，向研究对象抽取4ml的静脉血，使用RPMI1640的培养基进行培养，放置在培养箱内进行观察，对影响细胞培养的因素进行分析。结果在500个外周血染色体制片中的培养中成功了485例，15例在经过相应的补救措施后也获得了成功。在此次研究中都取得了良好的培养效果。结论在外周染色体制片中如果注意一些相关的方式可以提供成功率，确保外周血染色体制片的成功。

【关键词】外周血染色体制片；成功的方法；探讨

在人类的基因遗传中，染色体扮演着重要的角色。染色体是细胞核的重要组成部分，也是包含着遗传因素，是人类基因的载体[1]。在关于关于染色体的研究对人类的生育有着重要的意义，可以切实提高人口的素质。外周血染色体制片由于用血少易操作等优点被使用，但也存在着较大的问题，导致失败率高。为了提供外周血染色体制片的成功率，笔者进行了这一方面的探究。现报告如下：

1.资料与方法

1.1临床资料

将2014年3月至2016年3月来我院进行遗传咨询以及治疗的500名患者作为研究的对象，向研究对象抽取4ml的静脉血，使用RPMI1640的培养基进行培养，放置在培养箱内进行观察[2]。细胞培养的环境应该保持与体内的环境一致，首先应该是无菌无污染的环境，不影响细胞的培养；其次，温度需要保持在一定的温度，细胞培的最佳温度应该为36.5±0.5℃，一旦偏离这一温度，细胞的生长会受到影响；其三，细胞的培养需要相应的气体，主要是氧气以及二氧化碳，这是细胞培养不可缺少的。

1.2方法

1.2.1采集血液样本使用一次性注射器先采用0.5ml的肝素稀释液作为抗凝剂，在采取研究对象的血液样本，先用碘酒对研究对象的皮肤进行消毒，再用专门的橡皮管扎紧静脉回流的上端，用注射器抽取静脉血4ml。之后再将抽取的血液与肝素充分摇匀，防止血液凝固，而影响细胞的培养。

1.2.2接种以及培养培养基是影响培养的关键的因素，本此研究所采用的培养基为RPMI1640（5mL）。在无污染的操作环境下，先需要对所用的容器进行消毒后，将采取的外周血的血液样本接种到相应的培养基中，再轻轻摇晃，使之混合均匀。之后再放于培养箱中进行培养。培养箱的温度保持在36.5±0.5℃，同时控制培养箱的气体，保证细胞所需要的氧气以及二氧化碳，观察细胞的生长情况，控制好培养的时间，一般为72小时左右[3]。

1.2.3适量的秋水仙素以及时间秋水仙素在细胞培养中有重要的作用，可以抑制有丝分裂，是细胞培养中纺锤体遭到破坏，这可以使细胞中的染色体得到大量的分裂，从而更加有利于对核型的分析。可使分裂象细胞停留在分裂中期而获得大量分裂中期染色体以便于核型分析。适量的秋水仙素、相应的时机以及时间的长度都会对染色体的分裂有所影响，如果剂量过多、时间过长会使染色体浓缩；如果剂量不足、时间过短会使染色体不足；这都是不利用对核型的分析。本次研究中采用的秋水仙素剂量浓度为0.04μg/ml，时间长度为3h。

1.2.4离心力将培养的血细胞移出培养箱，放入离心管，并通过离心的方式得到细胞。在这个过程中需要控制好速度，速度过快，细胞容易粘连，速度过慢会使细胞丢失。本次研究采用1700r/min离心10min。

1.2.5低渗低渗是使染色体制片的一个重要的步骤，主要是让细胞获得充足的水分并破裂，使得染色体得到释放。低渗时需要把握时间，时间过长过短都不利于核型的分析[4]。本次研究采用主要加入0.075mol/L低渗液6mL，时间为30min左右。

1.2.6固定在结束低渗后，使用新鲜配置的固定液（甲醇与冰醋酸以3：1的比例进行配制）1ml进行固定，并通过离心的方式将清液舍弃。在静止一段时间后，再进行固定离心舍弃清液的步骤。本次研究采用1200r/min离心10min。

1.2.7染色体制片首先要保持载玻片的清洁程度，需要对进行消毒清洁。在细胞液中加入固定液0.5ml，并用轻轻吹打混合的液体。将其滴在载玻片上，并轻轻吹开，使细胞可以分散。同时将载玻片在酒精灯上进行微烤，把握时间，再在空气中进行自然地风干[5]。本次研究烤片采用70℃，时间为3h左右。在制片的时候应该多制几张，以保证成功率。同时，将剩余的细胞液保存起来，放于冰箱内，以便再次制片。

1.2.8消化及染片将烤好的染色体制片放在培养箱中，经过1d后再进行染色，使用PH值为7.1的0.025％胰蛋白酶的消化酶，将烤片放在该溶液中处理，时间为30s左右，并不断摇晃，使其接触充分。之后再放入盐水中进行漂洗，漂洗后放入PH7.2的PBS稀释的姬姆萨染液进行染色，时间为8min[6]。再将制片冲洗晾干后就能获得成功的染色体图像。

2.结果

本次外周血染色体制片的研究取得了良好的培养效果，在500个外周血染色体制片中的培养中成功了485例，15例在经过相应的补救措施后也获得了成功。

3.讨论

由于染色体的制片过程比较复杂，我国在对染色体上还没有良好的技术，在质量上存在着很大的问题，严重影响了我国在对人类生物工程上的研究以及进展。对此，笔者采取了来我院咨询及治疗的500名人员作为研究对象，并采用研究对象的血液作为研究的样本进行培养。在进行实验的过程中，对外周血染色体的各个步骤进行分析研究，得出最佳的培养方案，并总结出培养成功的经验，为今后的培养提供借鉴。培养过程中的每一个步骤都应该严肃对待，因为可以由于一些细微的原因就会造成制片的失败。在整个过程中需要尽量做到无菌操作，严格控制培养箱的环境，同时每一个步骤都应该控制好溶液的剂量以及作用的时间，为染色体制片成功提供保证。

参考文献：

[1]马强，刘青松，蔡燕，邢艳，张国元.外周血淋巴细胞培养及染色体制备的几点体会[J].国际检验医学杂志，2011，14：1641-1642.

[2]侯艳香.人外周血淋巴细胞培养染色体制备及影响因素[J].检验医学与临床，2013，07：874-875.

[3]张丽伟，苏雅拉图，王玉荣，邵小影.人体外周血淋巴细胞染色体的制片体会[J].内蒙古民族大学学报（自然科学版），2005，04：447-448.

[4]杜峰涛.人体外周血淋巴细胞染色体制备中应注意的几个问题[J].现代检验医学杂志，2007，01：23-24.

[5]黄江玲，林祥伟，邱少雄，陈乐川，刘兴进.人外周血淋巴细胞培养及染色体制备的方法及成功率[J].中国校医，2015，07：526-527.

[6]肖正华.改良的人体外周血淋巴细胞的培养与染色体标本的制作技术[J].第三军医大学学报，1994，06：450.