化学发光免疫分析方法及其应用

化学发光免疫分析方法及其应用

李惠军

(兰州市第二人民医院甘肃兰州730046)

【摘要】化学发光免疫分析方法因其具有灵敏度好、分析速度快、所需的设备简单等一系列优点，在医药、食品、环境检测等领域均有广泛地研究和应用。在实际的工作中，由于经典的化学发光免疫分析法对大量复杂的样品测定所需时间长、成本高、样品用量大等不足，不能满足实际需要。因而，建立快速、高灵敏度、高通量和低成本的检测方法成为化学发光免疫分析方法的研究热点和发展趋势。鉴于此，本文主要对近几年化学发光免疫分析方法的种类以及免疫分析方法的研究应用进行探讨。

【关键词】化学发光免疫；分析；方法；应用

【中图分类号】R927.1【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2016）01-0360-02

1.化学发光免疫分析方法的种类

化学发光免疫分析方法的发光机理是在化学发光反应体系中的反应物、中间体等物质分子，吸收了化学反应释放的能量，由此这些分子从基本状态活跃到激发状态，然后又从激发状态返回到基本状态中，在此过程中会释放能量的光，而免疫分析方法就是对这些光进行测定及定量分析。

化学发光免疫分析方法包括免疫化学反应和化学发光反应两大部分。免疫化学反应发光分析是把化学发光物质或酶通过化学方法标记在抗原或抗体上，然后抗原与抗体会发生特异性反应，继而形成抗原－抗体免疫复合物。化学发光分析就是上述所说的，使化学发光体从激发状态返回到基本状态，主要在化学免疫反应结束后，加入氧化剂或酶的发光底物，通过氧化形成处于激发态的中间体，这时发光体会释放能量回到稳定常态。

1.1化学发光免疫分析

化学发光免疫分析是十分常见的一种化学发光免疫分析方法，具体而言是直接利用化学发光剂对抗体和抗原进行直接标记的方法，常见的化学发光剂主要有两类，分别是鲁米诺和吖啶酯类发光剂。

首先介绍吖啶酯类标记剂的化学发光免疫分析。吖啶酯类化学发光剂产生的原因主要是因为热稳定性不佳，最终合成热稳定性较好的吖啶酯类衍生物。吖啶酯类化学发光剂的优点就在于化合物量子的产率相对较高，可以达到0.05，在标记的过程中，并且不需要加入催化剂，发光体系简单且快速，具有标记效率高、成本低的诸多特点。同时，吖啶酯类化学发光剂，会采用H2O2和NaOH元素作为发光启动试剂，而且还会加入表面活性剂使其发光增强。

对于鲁米诺类化学发光剂，主要进行氧化反应发光。鲁米诺类发光剂适用于碱性溶液的条件，可以使多种氧化剂氧化发光。同时为了增加氧化的速度，通常会添加无机催化剂或相关酶。鲁米诺发光的光子产率是0.01，要低于吖啶酯类化学发光剂，其最大的发射波长为425nm。

1.2化学发光酶免疫分析

化学发光酶免疫分析的工作原理是用酶标记生物活性物质，在此基础上进行免疫反应。在这个过程中，免疫反应复合物上的酶会对发光底物产生作用，进而在信号试剂的作用下发光，用于测定发光的仪器是发光信号测定仪。在化学发光酶免疫分析中常用的标记酶包括HRP（辣根过氧化物酶）和ALP（和碱性磷酸酶），这两种酶的发光底物是存在较大差别，分别有各自的发光特点及特性。

HRP经常使用的发光底物是鲁米诺及其衍生物。在实验过程中，通常标记抗体使用的酶类是过氧化酶，完成免疫反应后，这时就需要鲁米诺发光底物，然后发光试剂就会发生作用，同时决定发光强度的就是在酶免疫反应物中的酶的浓度，之后使鲁米诺发光，酶浓度的不同使鲁米诺发光程度也不尽相同。传统的化学发光体系一般只发生几秒的瞬时间发光，但在发光系统中加入发光剂，就会使发光的时间延长，可以进行测量和实验。ALP目前广泛应用于两种免疫分析，分别是酶联免疫分析和核酸杂交分析。ALP中的碱性磷酸酶和1，2－二氧环乙烷组成的发光体系是当前最重要且灵敏的化学发光体系，可以使化学分子结构更为稳定，并且产生光亮的时间较长，光亮的强度大。

1.3电化学发光免疫分析

电化学发光免疫分析的工作原理为：电化学反应导致的化学发光过程。电化学发光一般在电极的表面进行，经常使用的发光底物是三联吡啶钌，同时三丙胺作为激光反应。电化学发光反应具有很大的优势：（1）电化学反应发光时间长，灵敏度高；（2）电化学反应标记的分子小，可以同时标记多个，并且标记物十分稳定；（3）电化学发光免疫分析的光信号动力学范围较宽，线性好；（4）可以重复测量，进行多元检测；（5）光化学发光免疫完成一个样品分析通常只需十八分钟，具有快速、高效的特点，同时可以实现全自动化。电化学发光免疫分析应用较为成熟，主要应用于抗原、半抗原和抗体的免疫检测。

2.化学发光免疫分析的建立

（1）抗体制备。不论哪一类化学发光免疫分析法均离不开抗体的使用，因此，在化学发光免疫分析法的建立时，首先应制取满足方法的抗体。制备抗体利用的是动物对外来异己物排斥的作用，在血液当中形成针对词异己物的IgG（免疫球蛋白），也就是抗体。对这些体液予以提取则能够得到所需要的抗体。

（2）化学发光免疫分析标记技术。在化学发光免疫分析中，抗体标记与抗原标记是其中尤为重要的步骤。对于标记免疫环节，要求标记产物有稳定性质且不易脱落，并且标记之后要保持原抗体或者原抗原所具备的的活性，以及标记基团的发光活性。

3.化学发光免疫分析方法的应用

3.1环境科学的应用

化学发光免疫分析方法的应用主要体现于两种理论，即环境内分泌干扰物炔雌醇的免疫分析方法和微板式磁化学发光酶免疫分析方法。环境内分泌干扰物炔雌醇的免疫分析方法的检测限是0.2±0.1ng/L，当噪比是10时，这种方法的检测限是1.4±0.8ng/L，并且对表面水和污水处理厂污水中的炔雌醇进行检测和分析；另一个微板式磁化学发光酶免疫分析方法，主要是对检测水样中的17β—雌二醇实时检测，主要的工作原理的是利用高灵敏度的化学发光体系进行检验。这种方法的检测范围是10pg/mL到3000pg/mL，检验灵敏度为5.4pg/mL。通过对污水和表面水的检验，可测定出水质的情况，为环境检测和恢复提供所需的技术支持。

3.2医学检测应用

化学发光免疫分析方法已经应用到医学领域，在基础医学和临床上应用十分广泛，在医学检测方面发挥了尤为重要的作用。例如，根据国外媒体horpe等的报道，利用金刚烷衍生物在碱性磷酸酶作用下可发出高强度的光，而且这种光信号持续的时间比较长，达到1至2个小时。之后利用光化学免疫分析系统，酶为标记物的发光剂，即碱性磷酸酶，同时并且还有相匹配的系统。这项技术在医学上的应用可以用于监测的疾病较多，可以对患者进行甲状腺功能检测、传染病检测、药物检测、心脏病检测以及糖尿病检测等诸多疾病检测。

3.3食品安全的应用

化学发光免疫分析方法在食品安全的应用也是尤为广泛的，用于检测食品的构成成分，是否包含有害有毒物质，对保障食品安全，维护消费者的合法权益有重要的作用。例如，根据LiangP等报道，采用ECL来对牛奶中β-内酰胺类抗生素以及β-内酰胺酶进行检测，并且实验证明，这种检测方法安全有效。此外，还可以对蜂蜜等产品中四环素类抗生素残留予以检测。

4.结语

总之，面对大量而又复杂的样品测定，经典的化学发光免疫分析法所需时间长、成本高、样品用量大，这些不足之处给相关的实践工作增加了难度，而现代的化学发光免疫分析方法则解决了这些难题。随着科学技术的日新月异，化学发光免疫分析技术将会得到进一步的优化及完善，免疫分析的选择性、灵敏度、检测速度和检测通量均将得到大幅度的提高；为满足临床及生命科学等领域发展的需要，化学发光分析仪也将向微型化、集成化和自动化方向进一步发展。化学发光免疫分析法的应用领域不断扩大，将逐步渗透到临床治疗、药物分析乃至生命科学等诸多领域，笔者坚信，随着化学发光免疫分析技术的发展及完善，必将给人们的生命质量的提高带来积极的影响。

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