泛素结合酶及血管内皮生长因子D在脑胶质瘤中的表达

泛素结合酶及血管内皮生长因子D在脑胶质瘤中的表达

张晓辉通讯作者杜金荣宋一村邱枫王正彩李楠

张晓辉通讯作者杜金荣宋一村邱枫王正彩李楠哈尔滨医科大学第四临床医学院病理科黑龙江哈尔滨１５０００１基金项目:黑龙江省卫生厅科研课题(２０１２－７１９)作者简介:张晓辉(１９７６－),女,黑龙江哈尔滨人,硕士,主治医师.

【摘要】目的探讨泛素结合酶及血管内皮生长因子D在脑胶质瘤中的表达及意义.方法用免疫组化法检测UBE２S和VEGF－D在２０例WHOI~II、２０例WHOIII、２０例WHOIV脑胶质瘤中的表达,同时进行微脉管密度的计数.结果(１)UBE２S和VEGF－D在高级别胶质瘤中的表达与低级别相比显著升高(P＜０．０５).(２)UBE２S和VEGF－D在脑胶质瘤中的表达有显著相关性(p＜０．０１).(３)微淋巴管密度与VEGF－D蛋白表达显著相关(p＜０．０１),与UBE２S蛋白表达有相关性(P＜０．０５).(４)微血管密度与VEGF－D蛋白表达显著相关(p＜０．０１),与UBE２S蛋白表达显著相关(P＜０．０１).结论脑胶质瘤中,UBE２S和VEGF－D可促进微淋巴管及微血管的生长.UBE２S可能提高VEGF－D在脑胶质瘤中的表达.评估UBE２S和VEGF－D对脑胶质瘤的脉管生成及分级有意义.【关键词】泛素结合酶;血管内皮生长因子D;胶质瘤ExpressionofubiquitincarrierproteinandvascularendothelialgrowthfactorDinglioma?ZHANGXiao－hui,△,DUJin－rong,SONGYi－cun,LINan,QIUFeng,WANGZheng－cai(DepartmentofPathology,TheForthClinicalCollege,HarbinMedicalUniversity,Harbin１５０００１,China)【Abstract】Objective:TostudytheexpressionofubiquitincarrierproteinandvascularendothelialgrowthfactorDinglioma,withtheclinicalsignificance．Methods:Total６０casesofglioma,２０casesofWHOI~II,２０casesofWHOIII,２０casesofWHOIVtissuesweredetectedfortheexpressionofubiquitincarrierprotein(UBE２S)andvascularendothelialgrowthfactorDprotein(VEGF－D)bymeansofimmunohistochemicalSP．Results:(１)UBE２SandVEGF－DexpresＧsionwerebothsignificantlyincreasedingeliomaWHOIVthanthatinWHOI~II(P＜０．０５)．(２)TherewasstatisticallysignificantrelationshipbetweenVEGF－DandUBE２Singlioma(p＜０．０１)．(３)AbsorbentvesselsdensitywereassociatedwiththeexpressionofVEGF－D(p＜０．０１)andUBE２S(P＜０．０５)．(４)MicrovesseldensitywascloselyrelatedtoexpressionofVEGF－D(p＜０．０１)andexpressionofUBE２S(P＜０．０１)．Conclusion:VEGF－DandUBE２Singlioma,arerelatedtolymphangiogenesisandangiogenesis．UBE２SmayincreaseexpressionofVEGF－Dinglioma．VEGF－DandUBE２Sexpressioncanbeusefulpredictorofhighgrade【Kgleiyomwaor．ds】Ubiquitincarrierprotein;EndothelialgrowthfactorD;Gioma【中图分类号】R７３９．４．４【文献标识码】A【文章编号】１００８－６３１５(２０１５)１０－０２３４－０２

淋巴管与血管的增生是脑胶质瘤恶性变的重要指征,也是脑胶质瘤难治及复发主要原因.控制脑胶质瘤脉管的转化与增生,研究特异性抑制血管生长的药物一直是肿瘤研究的热点,肿瘤血管的新生与成熟受多种细胞因子的多因素调节,其中泛素－蛋白酶体系和血管内皮细胞生长因子(VEGF)家族作用尤为突出[１,２].我们对脑胶质瘤组织中泛素结合酶(UBE２S)及血管内皮生长因子D(VEGF－D)的表达,结合肿瘤中微脉管密度的研究,探讨其在脑胶质瘤中的相互关系及在微脉管发生发展中的作用.１材料与方法

１．１材料

收集哈尔滨医科大学附属四院病理科２００８年至２０１２年６０例脑胶质瘤手术切除存档蜡块,所有患者术前均未经放化疗治疗.同时收集脑血管畸形患者标本中正常脑组织作为对照.全部标本经１０％中性甲醛固定,常规脱水,石蜡包埋,常规组织切片.于哈尔滨医科大学附属四院病理科分别进行HE和免疫组织化学染色.６０例脑胶质瘤中２０例为WHOI－II,２０例为WH０III,２０例为WHOIV;男性５８例,女性３２例,年龄２８－８５岁,平均年龄５９．２１岁.１．２方法免疫组化抗体:CD３４及D２－４０单抗购自福州迈新生物技术开发公司,VEGF－D及UBE２S多抗购自北京中杉生物技术公司.免疫组织化学染色:严格按链霉素抗生物素蛋白－过氧化物酶(SP)法,其中抗VEGF－D、抗UBE２S及抗D２－４０经高温高压修复预处理,Ph６．０柠檬酸缓冲液中(０．０５mol/L)煮沸修复;抗CD３４经EDTA水浴修复预处理后在Ph８．０的EDTA缓冲液中过夜修复.１．３结果判定免疫组化结果采用半定量分析,UBE２S以胞核呈清晰棕黄色颗粒为阳性,VEGF－D主要表达于细胞胞浆,以胞浆呈棕黄色颗粒为阳性,CD３４及D２－４０为内皮细胞胞浆呈棕黄色为阳性[３].CD３４阳性视为微血管,D２－４０阳性视为微淋巴管.微血管密度(MVD)及淋巴管密度的计数方法低倍镜下确定３个微脉管着色最密集的区域,然后在高倍镜下计数微脉管数,取３个视野平均值作为微脉管密度值[４]１．４统计学处理数据处理在SPSS１０．０软件上进行分析,采用t检验及方差分析.２结果２．１UBE２S和VEGF－D在脑胶质瘤中的表达６０例脑胶质瘤中UBE２S阳性率为４３．３％(２６/６０),阳性产物为棕黄色颗粒,位于肿瘤细胞核内.２０例WHOI－II级脑胶质瘤组织中UBE２S阳性率１５．０％(３/２０),２０例WHOIII级脑胶质瘤组织中UBE２S阳性率４５．０％(９/２０),２０例WHOIV级脑胶质瘤组织中UBE２S阳性率７０．０％(１４/２０).随着肿瘤级别的升高,UBE２S表达率逐渐增高(见图１).UBE２S在不同级别脑胶质瘤中的表达差别有显著性(P＜０．０５)(见表１).实验图表表１UBE２S与VEGFR－D在脑胶质瘤中的表达

图２在低级别脑胶质瘤中微血管生成较少(２a),在高级别脑胶质瘤中微血管生成较多(２b),SP法(IHCx４００).Fig２Thepoorgrothofcapillaryinlow－gradeGlioma(２a),thestronggrothofcapillaryinhigh－gradeGlioma(２b)withspmethod(IHCx４００)．６０例脑胶质瘤中VEGF－D阳性率为５１．７％(３１/６０).２０例WHOI－II级脑胶质瘤组织中VEGF－D阳性率３５．０％(７/２０),２０例WHOIII级脑胶质瘤组织中VEGF－D阳性率５０．０％(１０/２０),２０例WHOIV级脑胶质瘤组织中VEGF－D阳性率７０．０％(１４/２０).随着肿瘤级别的升高,VEGF－D表达率逐渐增高,微脉管数量逐渐增多(见图２).WHOIV级与WHOI－II比较,VEGF－D在脑胶质瘤中的表达差别有显著性(P＜０．０５)(见表１).

２．２VEGF－D表达与UBE２S表达的关系随脑胶质瘤级别的升高,VEGF－D表达与UBE２S表达都增高,在２６例UBE２S阳性表达的肿瘤中,有２５例同时存在VEGF－D的阳性表达(９６．１５％),有１例存在VEGF－D的阴性表达(３．８５％).３４例UBE２S阴性表达的肿瘤中同时存在VEGF－D的阳性表达１０例(２９．４１％),阴性表达２４例(７０．５９％).两者在脑胶质瘤中的阳性表达存在显著相关性(P＜０．０１).２．３VEGF－D及UBE２S在脑胶质瘤中的表达与微血管及微淋巴管密度的关系６０例脑胶质瘤微血管密度２~２５个,平均(１３．５１±６．１２６)个.微血管密度与VEGF－D表达(P＜０．０１),UBE２S表达(P＜０．０１)呈正相关.６０例脑胶质瘤微淋巴管密度１~１９个,平均(７．６２±９．４３１)个.微淋巴管密度与VEGF－D表达(P＜０．０１),UBE２S表达(P＜０．０５)呈正相关.３讨论脑胶质瘤中血管的新生与成熟受多种细胞因子的多因素调节,如:血管内皮细胞生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)、转化生长因子－β(transforminggrowthfactorβ,TGF－β)、血管生成素(angiopoietin,Ang)及其酪氨酸激酶受体－２(tyrosinkinasewithimmunoglobulin－like)andepidermalgrowthfactorhomologydomains,Tie－２)等[５].其中,VEGF家族(包括VEGF－A,VEGF－B,VEGF－C,VEGF－D,VEGF－E和胎盘生长因子)是新生血管生成中必不可少的关键因子,是特异性地作用于内皮细胞的一组生长因子.VEGF通过刺激血管内皮细胞的有丝分裂、迁徙、增加血管的通透性、诱导毛细血管腔的形成并可改变血管内皮细胞的基因表达水平,促进纤维蛋白及间质胶原酶的激活更有利于新生血管形成,加快肿瘤的演进过程[３].VEGF－D属于VEGF家族成员之一,是较为特异的淋巴管内皮生长因子,与VEGF－C结构及功能相近,与其配体VEGFR－２、VEGFR－３结合,通过MEK/ERK和PI３－激酶/AKT途径促进淋巴管内皮增生[４].本实验证明,在胶质瘤中VEGF－D表达增强,且随着肿瘤级别的升高,表达强度逐渐增强.并证明VEGF－D在脑胶质瘤的发展及脉管的发生发展中有重要作用.蛋白质的泛素化降解是真核生物蛋白降解的主要途径,蛋白质泛素化降解需要ATP和三个重要的酶的参与:泛素活化酶(Activatingenzymes)E１、泛素交联酶E２(ConjugatingenzymesE２)和泛素连接酶E３(LigaseE３)[６,７].在泛素化修饰途径中主要是由E３酶来提供底物特异性,有时也由E３酶和E２酶一起,共同提供底物特异性[８,９,１２].为了实现高度特异性的目的,细胞表达了很多种不同的E２、E３酶,这些酶都参与到细胞内的各种调控途径之中[１０,１１].UBE２s是蛋白泛素化降解的一个关键酶,在多种肿瘤中高水平表达[１３].最近研究发现,UBE２s的表达与低氧诱导因子HIF１α(Hypoxia－induciblefactors１alpha,HIF１α)的表达密切相关[１４,１６].UBE２s通过降解pVHL(VonHippel–Lindautumorsuppressor,PVHL)间接调节HIF１α的水平[１５,１７].另外,一些研究表明,UBE２s还参与泛素化链的延伸并与细胞周期的调控有关[１８].在乳腺癌患者中,UBE２s高水平表达的病人,病程短,术后生存期更短[１９].病理组织中UBE２s表达很高的病人,对放化疗具有很强的耐受性,提示UBE２s可能参与肿瘤的放化疗耐受[２０].２０１１年,美国密歇根大学研究发现泛素连接酶SAG/RBX２/ROC２通过泛素化降解NF１影响血管和神经系统发育[２１].据此,我们推测泛素连接酶可能与肿瘤血管发生发展有关.本实验证明在脑胶质瘤中UBE２s的表达与微淋巴管及微血管的发生发展有关,且随肿瘤级别增高,表达逐渐加强.UBE２s的表达可能促进VEGF－D的表达.参考文献[１]Gieracka－PazuchaD,TurowskiG．．Theubiquitinsystem－structure[andfunction[J]．PrzeglLek,２００１,５８(１０):９３２－５．２]HarperJW,TanMK,Ubiquitionpathwayproteomics[J]．MolCellProＧ[teomics,２０１２,１１:１５４１－１５５０．３]LarcherF,MurillasR,BolontradeM,etal．VEFG/VPFoverespressioninskinoftransgenicmiceinducesangiogenesis,vascularhyperperme－aＧbilityandacceleratedtumordevelopment[J]．Oncogene,１９９８,１７(３):３０３[－３１１．４]YonemuraY,EndoY,FujitaH,etal．RoleofvascularendothelialgrowthfactorCexpressioninthedevelopmentoflymphnodemetastasis[ingastriccancer[J]．ClinCancerRes,１９９９,５(７):１８２３－１８２９．５]KomanderD,RapeM．Theubiquitincode[J]．AnnuRevBiochem,[２０１２,８１:２０３－２２９．６]WuT,MerblY,HuoJ,etal．UBE２SdriveselongationofK１１－linkedubiquitinchainsbytheanaphase－promotingcomplex[J]．ProcNatl[AcadSciUSA,２０１０,１０７:１３５５－１３６０．７]PannerA,CraneC,WengA,etal．Ubiquitin－specificprotease８linksthePTEN－Akt－AIP４pathwaytothecontrolofFLIPSstabilityandTRAILsensitivityinglioblastomamultiforme[J]．CancerRes２０１０,７０:[５０４６－５０５３．８]Minshen,Saraschmitt,Danielabuac,etal．Targetingtheubiquitinproteasomesystemforcancertherapy[J]．ExpertOpinTherTargets,[２０１３,１７:１０９１－１１０８．９]GarnettM．J,MansfeldC,GodwinT,etal．UBE２SelongatesubiquitinchainsonAPC/Csubstratestopromotemitoticexit[J]．NatCellBiol,[２００９,１１:１３６３－１３６９．１０]FraileJM,QuesadaV,RodriguezD,etal．Deubiquitinasesincancer:newfunctionsandtherapeuticoptions[J]．Oncogene,２０１２,３１:２３７３[－２３８８．１１]SarikasA,HartmannT,PanZQ．Thecullinproteinfamily[J]．[GenomeBiol,２０１１,１２:２２０．１２]MatsumotoML,WickliffeKE,DongKC,etal．K１１－linkedpolyubiqＧuitinationincellcyclecontrolrevealedbyaK１１linkage－specific[antibody[J]．MolCell,２０１０,３９:４７７－４８４．１３]MetzgerMB,HristovaVA,WeissmanAM．HECTandRINGfingerfamiliesofE３ubiquitinligasesataglance[J]．JCellSci,２０１２,１２５:５３１[－５３７．１４]SilvermanJS,SkaarJR,PaganoM．SCFubiquitinligasesinthemainＧ[tenanceofgenomestability[J]．TrendsBiochemSci,２０１２,３７:６６－７３．１５]JiaL,SunY．SCFE３ubiquitinligasesasanticancertargets[J]．Curr[CancerDrugTARGETS,２０１１,１１:３４７－３５６．１６]MathewR,SeilerMP,ScanlonST,etal．BTB－ZFfactorsrecruittheE３ligasecullin３toregulatelymphoideffectorprograms[J]．Nature,[２０１２,４９１:６１８－６２１．１７]SiuKT,RosnerMR,MinellaAC．AnintegratedviewofcyclinEfuncＧ[tionandregulation[J]．CellCycle,２０１２,１１:５７－６４．１８]HaagensonKK,TaitL,WangJ,etal．Cullin－３proteinexpressionlevelscorrelatewithbreastcancerprogression[J]．CancerBiolTher,[２０１２,１３:１０４２－１０４６．１９]WeidnerN．CurrentpathologicmethodsformeasuringintratumoralmiＧcrovesseldensitywithinbreastcarcinomaandothersolidtumors[J]．[BreastCancerResTreat,１９９５,３６(２):１６９－１７３．２０]YinY,LinC,KimST,etal．TheE３ubiquitinligaseCullin４AreguＧlatesmeioticprogressioninmousespermatogenesis[J]．DevBipl,２０１１,[３５６:５１－６２．２１]SunY,LiH,FunctionalcharacterzationofSAG/RBX２/ROC２/RNF７,anantioxidantproteinandanE３ubiquitinligase[J]．ProteinCell,２０１３,４:１０３－１１６．