端粒酶活性的检测与胃癌预后关系的研究

端粒酶活性的检测与胃癌预后关系的研究

杨晓峰赵海英

杨晓峰赵海英（临沂市人民医院急诊外科山东临沂276001）

【中图分类号】R735.2【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2012）48-0025-03

【摘要】目的本研究检测胃癌组织中端粒酶活性蛋白的表达，旨在探索端粒酶表达与胃癌的生物学行为和患者预后的关系。方法应用TRAP-PCR银染法检测40例胃癌组织和15例正常胃组织中端粒酶活性。同时收集每一例胃癌患者的临床病理资料，并将上述标记物与患者的临床病理参数（年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤部位、病理类型、组织分化程度、浸润深度、淋巴结转移情况、pTNM分期）进行相关性分析。结果端粒酶在正常胃粘膜的表达为13.3%(2/15)，胃癌组织中端粒酶阳性表达率为77.5%（31/40）,差异有显著性P＜0.01；端粒酶的表达与肿瘤浸润深度、pTNM分期及有淋巴结转移呈正相关P＜0.01。Logistic多因素回归分析示：端粒酶活性是与肿瘤浸润深度相关的危险因素（P﹤0.05）。结论胃癌组织中端粒酶活性与胃癌的浸润转移密切相关，对它的检测有助于对胃癌患者的转移和预后做出更准确地判断，更好的指导胃癌的治疗。

【关键词】胃癌端粒酶活性临床病理参数预后转移

胃癌是严重危害人类健康最常见的恶性肿瘤之一，胃癌发病率在全球范围内仅次于肺癌居第二位，胃癌在亚洲地区更为突出，在我国男性胃癌发病率仅次于肺癌，女性胃癌为第四位高发癌[1]。侵袭与转移是胃癌的重要生物学行为之一，其全过程包括：癌基因的激活[2]；抑癌基因失活[3]；端粒酶(telomerase)活化-细胞永生化；细胞转移相关基因及凋亡抑制基因的失调等。这些基因和蛋白表达的增加或降低均为临床检测浸润转移提供了分子标记物。近年来分子生物学研究的进展极大帮助研究人员从分子生物学水平认识恶性肿瘤的发生与演进。本课题采用TRAP-PCR银染法检测胃癌组织中端粒酶活性,探讨其与病人临床病理学特征的关系，旨在从分子水平分析胃癌转移相关因素，并评价上述生物学指标判断胃癌预后的价值。

1资料与方法

1.1病例及手术标本收集

收集我院胃肠外科2010年3月至2010年10月之间的40例行胃癌根治术的新鲜瘤体组织标本，所有标本修剪后用生理盐水清洗，冻存在-80℃冰箱中做长期保存。所有病例中男性32例，女性8例；年龄18-77岁，平均57.9岁，正常对照组15例均为胃良性手术病例。所有入选病例按2003年UICC及AJCC联合修订的胃癌分期标准进行区域淋巴结转移分站及pTNM分期。

1.2胃癌组织中端粒酶活性的检测

采用TRAP-PCR银染法测定胃癌组织中端粒酶的活性，取-80℃保存组织约50－100mg，液氮研磨，按照端粒酶活性检测试剂盒(北京鼎国生物技术公司)提取端粒酶复合物，然后再加入1ulCX引物，1ulTaq酶，2滴石蜡油，离心数秒，按下列参数循环35轮：90℃45秒50℃45秒72℃60秒；PCR产物用12％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，凝胶行银染。

1.3阳性结果判定及图像定量分析

阳性判断标准为：片段大小在75bp以上有6条以上的完整条带，且条带之间间隔6bp；所有电泳图像imageJ软件检测光密度，≥80％阳性对照平均光密度值为强阳性。

1.4统计学方法

所以数据经SPSS17.0软件包进行统计数据分析。各组间均数比较用单因素方差分析，组间两两比较用T检验。阳性率的比较用普通x2检验；若理论数小于5，用校正的x2检验；若理论数小于1或所得P≈α，改用确切概率法。P<0.05为差异有显著性。

2结果

2.1胃癌组织中端粒酶的表达情况与临床病理参数的关系

胃癌组织的端粒酶阳性表达率为77.5%（31/40）,正常胃粘膜的阳性表达率13.3%(2/15)（P＝0.0093）；在pTNM分期中Ⅲ-Ⅳ期端粒酶的阳性表达率为95.46%,Ⅰ-Ⅱ期组的为55.56%（P＝0.0086）；肿瘤浸润至肌层、浆膜层的阳性表达率分别为73.33％、75％，浸润至浆膜外层的阳性表达率为88.89％（P＝0.0046）；端粒酶在淋巴结转移组的阳性表达率为90.48%,无淋巴结转移组的为63.16%（P＝0.001）。在端粒酶表达阳性的胃癌组织中，肿瘤浸润至肌层、浆膜层端粒酶的强阳性表达率为27.62％、42.67％，浸润至浆膜外层的强阳性表达率为75％（P＝0.0198）；淋巴结转移组端粒酶的强阳性表达率为68.42%,无淋巴结转移组的为16.37%（P＝0.0091）。端粒酶的表达与肿瘤浸润深度、pTNM分期及有淋巴结转移呈正相关。

因40例胃癌病理组织分级Ⅰ级只有1例，故合并入Ⅱ级进行统计分析。在pTNM分期中将Ⅰ、Ⅱ期合并，Ⅲ、Ⅳ期合并进行统计分析，详细结果见图1和表1、2。

注：*浸润至肌层与浸润至浆膜外层有显著性差异（P＝0.0046）;※无淋巴结转移与有淋巴结转移有显著性差异（P＝0.001）;#Ⅰ＋Ⅱ期与Ⅲ＋Ⅳ期有显著性差异（P＝0.0086）。

表2胃癌组织中端粒酶阳性强度与肿瘤浸润、淋巴结转移的关系

注：*浸润至肌层与浸润至浆膜外层有显著性差异（P＝0.0198）；#无淋巴结转移与有淋巴结转移有显著性差异（P＝0.009）。

2.2端粒酶活性与胃癌预后因素的相关性分析

应用单因素线性回归分析，将端粒酶端粒酶活性输入方程，进入水准为0.05，删除水准为0.1，评价其与胃癌预后是否相关。最终分析显示：端粒酶活性、MMP2蛋白的表达是与肿瘤浸润深度相关的危险因素（P<0.05）；与淋巴结转移相关的危险因素为DI值（P<0.01）；与pTNM分期相关的危险因素为MMP2蛋白的表达和DI值（P<0.05、P<0.01）。

3讨论

本研究对40例胃癌标本进行了TRAP-PCR银染法检测，发现胃癌组织的端粒酶活性表达阳性率为77.5%（31/40）。端粒酶的表达与肿瘤浸润深度、pTNM分期及淋巴结转移呈正相关：在pTNM分期中Ⅲ-Ⅳ期的阳性表达率为95.46%,Ⅰ-Ⅱ期的为55.56%，两组比较有显著性差异（P<0.05），说明随着pTNM分期的增加，端粒酶的活性增加，端粒酶在肿瘤浸润肌层和浆膜层的阳性表达率分别为73.33％及75％，浸润至浆膜外层的阳性表达率为88.89％，两组比较有显著性差异（P<0.01），表明端粒酶的表达随着肿瘤浸润深度的增加而增高；端粒酶在淋巴结转移组的阳性表达率为90.48%,无淋巴结转移组的为63.16%，两组比较亦有显著性差异（P<0.01），提示端粒酶的表达随着淋巴结转移的出现而增高。与国内外文献报道相似。本研究还发现，胃癌组织中端粒酶随着肿瘤浸润深度的增加及淋巴结转移的出现表达强度增加（P<0.05、P<0.01）。综上所述胃癌组织中端粒酶活性表达越高，患者的预后越差。端粒酶活性阳性率与患者的性别、年龄、肿瘤的部位、肿瘤的大小、病理类型、分化程度没有显著差异。

肿瘤转移是一个多步骤复杂过程，涉及到多个环节，此过程既与肿瘤细胞自身生物学特性有关，也受多种转移相关基因的调控。本研究从端粒酶活性探讨胃癌转移相关因素，目前认为在诸多影响胃癌预后的病理因素中肿瘤病灶的浸润深度、淋巴结转移及pTNM分期是影响胃癌预后最重要的因素，我们将胃癌组织中端粒酶活性与上述影响胃癌预后的病理因素进行单因素回归分析显示：端粒酶活性是与肿瘤浸润深度相关的危险因素（P﹤0.05）；由此可以看出端粒酶活性是影响胃癌预后的独立生物学指标，对端粒酶活性的检测能较好的反映胃癌组织的病理生物学行为，对胃癌患者预后的判断和术后指导治疗可提供更详细的临床资料，从而提高对预后判断准确性、客观性，更好地在临床上指导术后患者的进一步治疗。

参考文献

[1]Lin,F.andW.L.Wu,Surgicaltreatmentforadvancedgastriccancer.ZhonghuaWeiChangWaiKeZaZhi,2011，14(2):p81-3.

[2]Chouard,T.Structuralbiology:Breakingtheproteinrules.Nature,2011，471(7337):p151-3.

[3]Sun,J.L.,etal.EffectsofcombinedtherapyofLY294002andSN50onnudemicemodelwithgastriccancer.ZhonghuaWeiChangWaiKeZaZhi,2011，14(5):p364-7.