重组CYP2C19酶验证沙利度胺的经酶代谢

重组CYP2C19酶验证沙利度胺的经酶代谢

李兵

李兵（东莞康华医院药剂科临床药学室广东东莞511700）

【摘要】目的验证沙利度胺在人体内经CYP2C19酶代谢。方法将重组CYP2C19-沙利度胺进行体外孵育，用HPLC检测沙利度胺的浓度。结果沙利度胺在灭活的重组CYP2C19孵育液中孵育后浓度无变化，而在重组CYP2C19孵育液中孵育后浓度降到检测限以下。结论沙利度胺在人体内被CYP2C19代谢得到证实。

【关键词】沙利度胺CYP2C19HPLC

沙利度胺（Thalidomide,Thd）沙利度胺1954年作为镇静药在欧洲上市后，因致婴儿海豹肢畸形及无肢畸形于1964年撤市。后来发现沙利度胺具有抗炎及抗血管增生作用，被FDA批准治疗麻风结节红斑和多发性骨髓瘤[1-3]。Ando等研究后发现沙利度胺经过CYP2C19酶代谢成活性产物而起作用[4]。CYP2C19在中国具有明显的基因多态性。为验证沙利度胺是否为CYP2C19介导代谢，我们使用了重组CYP2C19酶来考察其代谢情况。

1材料与方法

1.1试剂与仪器恒温水浴振荡器（SHA-C型，金坛富华仪器公司生产）；电子分析天平（SartoriusBT124S）；pH计（OAKTON510型，新加坡EUTECH公司）；HPLC（1525-717-2487，美国Waters）。重组CYP2C19酶（BDGentest生产）。沙利度胺（Sigma公司,批号025K4603）。其余孵育体系试剂均采用市售分析纯，HPLC试剂采用色谱纯。

2实验方法

2.1主要溶液配制

(1)Tris-HCl缓冲液的配制：称取适量Tris、EDTA和DTT，用含有20%甘油的双蒸水溶解制成含0.1MTris，0.1mMEDTA.，0.1mMDTT的溶液，用6M的HCl调pH至7.4。用于肝微粒体的稀释。

(2)磷酸盐缓冲液（pH7.4）的配制：称取适量K2HPO4，KH2PO4，EDTA和MgCl2，双蒸水溶解制成0.1M磷酸盐,1mMEDTA，3mMMgCl2的溶液。用于肝微粒体的孵育。

2.2肝微粒体孵育及孵育液药物浓度检测

重组CYP2C19（50pM）孵育体系200μl，不同浓度的沙利度胺（0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mL），置于1.5ml聚丙烯离心管中，37℃水浴预孵育5min后，加入NADPH（10μM）启动孵育反应，60min后迅速冰浴，并加入冰冷的提取剂（乙酸乙酯）1.0ml，旋涡振荡2min,静置5min，16000rpm离心5min，转移上清液850μl至另一1.5ml离心管中，于真空干燥器中挥干，残渣用流动相（乙腈-水（含25mmol/L磷酸二氢钾,PH3.5）（15：85，v/v））100μl复溶，加入内标phenacitin（10μg/mL）旋涡混合2min，16000rpm离心3min，取上清80μl加入样品瓶，进样10μl，流速1ml/min,220nm、248nm双波长扫描。同时用灭活重组CYP2C19作一空白对照进行试验。整个实验操作避光进行。

3结果

沙利度胺在色谱的保留时间为23.5～25.5分钟，内标保留时间为28.5～30.5分钟。灭活的重组CYP2C19与沙利度胺孵育后，沙利度胺原型药浓度没有发生改变。而与有活性的重组CYP2C19孵育后，三组不同药物浓度的原型药沙利度胺的浓度均降至检测限以下。见下图。

(A)1μg/mL沙利度胺标准液色谱图（左图220nm波长，右图248nm波长）

4讨论

Ando通过实验证实沙利度胺在人体主要代谢酶是CYP2C19。其5-羟基代谢产物和5’-羟基代谢产物能够抑制血管增生。虽然沙利度胺在人体内的消除主要方式是自发性水解，但其水解产物并不具药物活性。因此有临床意义的途径是经CYP2C19代谢。重组CYP2C19酶为基因工程人源纯酶，更容易预测药物体内代谢[6]。从本实验中可以看出，与人体血药浓度相近的浓度均能够被CYP2C19代谢。其代谢物的浓度和活性的测定有待进一步研究。人体的CYP2C19基因多态性势必会影响沙利度胺的代谢水平。

参考文献

[1]TeoSK,ResztakKE,SchefflerMA,etal.Thalidomideinthetreatmentofleprosy.MicrobesInfect,2002,4:1193–202.

[2]NightinggaleSL.Fromthefoodanddrugadministration.JAMA,1998,280:872.

[3]SinghalS,MehtaJ,DesikanR,AyersD,RobersonP,EddlemonP,MunchiNetal.Antitumoractivityofthalidomideinrefractorymultiplemyeloma.NEnglJMed,1999,341:1565-1571.

[4]YuichiAndo,EiichiFuse,andWilliamD.ThalidomideMetabolismbytheCYP2CSubfamily.ClinicalCancerResearch,2002,8:1964–1973.

[5]MichaelEFranks,GordonRMacpherson,WilliamDFigg.Review:thalidomide.TheLancet,2004,363:1802-1804.

[6]王海学,邓巧琳.CYP450s体外重组技术及在药物代谢和安全性评价中的应用.中国药理学通报,2001,6:621-623.