流式细胞术在乳酸菌自溶检测中的应用

流式细胞术在乳酸菌自溶检测中的应用

王春绪 1 刘文凤 2

1 身份证号： 13082719851017**** ， 河北 唐山 064000

²身份证号：13110219870901****，河北 唐山 064000

摘要：流式细胞术是20世纪70年代初发展起来的一项高新技术,它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体，是对快速直线运动状态中的细胞、生物颗粒或液体中的大分子物质进行多参数的、快速的定量分析和分选的一种技术。本研究即使用流式细胞术测定菌体自溶度，建立了一种准确、快速的乳酸菌自溶检测方法，为乳酸菌的自溶特性研究提供便利。

关键词：流式细胞术；乳酸菌自溶检测；应用

1 材料和方法

1.1 材料

供试菌株均来自于本实验室储备菌株，经API系统鉴定，置信区间均在98%以上，分别为嗜热链球菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、和乳酸乳杆菌。纯化菌株用冷冻干燥机冻干保存于－80℃低温冰箱，使用时经MRS肉汤37℃条件下培养活化3次以上，储存于4℃冰箱备用。

1.2 菌体制备

活化菌株于MRS肉汤培养基37℃下培养至稳定期，离心收集菌体细胞，重悬于PBS缓冲液中，置于37℃保温，分别在4、8、16、24h取样，离心收集菌体细胞(3000×g，5min)，并用PBS缓冲液冲洗2次之后进行PI染色。

1.3 流式细胞仪(FCM)检测

将1.2中所得菌体细胞重悬于PBS缓冲液并调整吸光值(OD650)到1.0左右，使菌悬液细胞数控制在1×107cells/mL，取1mL菌液离心(3000×g，5min)弃上清液重悬于同体积PI-PBS染液中，4℃避光染色30min，以400目铜网过滤，上流式细胞仪进行测定。FCM检测光源为氩离子激光，氩离子激发光波长488nm，检测器FL3检测波长650nm，每个样品收集1×105个细胞。以未经PI染色的菌悬液设置阴性对照;以经过热处理(70℃10min)的菌悬液染色作为阳性对照，用CellQuest软件进行数据分析。

2 结果和讨论

2.1 FCM分析乳酸菌自溶结果

碘化丙锭(PI)可与细胞内的DNA嵌合，对细菌进行标记，但是PI不能穿透活细菌的细胞膜，它只能在细胞膜破损的情况下进入细菌内，并与细菌DNA和RNA相结合，在488nm的激光激发下，可在波长660nm左右检测到红色荧光信号。利用PI的这一特性可标记乳酸菌的自溶状况:乳酸菌在自溶初期细胞膜通透性增加，到自溶后期细胞膜破裂，这一过程中细胞阳性染色率将逐渐增大，在流式细胞仪中收集样品信号，根据细胞所处的位置设合适的“门”，将其分为染色阳性区与染色阴性区，得到相应的FCM图谱，如图1中所示即为乳酸菌LD3在自溶期间，图中A、B分别为细胞全阴性与全阳性对照。

图1菌株LD3的PI－PBS染色FCM直方图谱

图中横坐标FL3-H表示细胞荧光强度，纵坐标Counts为细胞频率。由图1中A、B可知，以FL3-H在101处设门，未经PI染色的阴性对照中的染色阳性率为1.72%，热致死后阳性对照中PI染色阳性率为99.59%。其中阴性对照中的细胞染色阳性率略高是因为菌液中可能存有的菌体细胞残片及其他蛋白、杂质等干扰所致，所以要求在每次试验时，均需设置阴性对照以扣除这些干扰因素。使用CellQuest软件对流式细胞仪读取数据进行联机分析，可以直接得到PI染色呈阳性的细胞数与细胞总数的比率，每个样本上机检测时间根据菌液浓度大小在40S－100S之间。

2.2 FCM方法的精密度

表1 FCM法检测乳酸菌自溶精密度试验(n=5)

对于乳酸菌自溶机理目前虽尚未有明确认识，但是多数研究认为乳酸菌的自溶与其生长繁殖过程息息相关，在一项对嗜酸乳杆菌自溶酶Acma的研究中发现，缺乏Acma基因的菌体细胞会形成长链并生长缓慢甚至停滞，说明自溶酶可通过影响细胞膜的溶解从而影响整个细胞的分离过程。在本研究中发现，在37℃缓冲溶液保温时，乳酸菌的自溶呈现先升后降的状态:在相对于培养状态的迟滞期时菌体自溶率较低，当进入指数生长期时自溶率最高，此后随着菌体生长进入平稳期，自溶率又逐渐下降。这一结果与Riepe等学者的自溶高峰发生于菌体细胞分裂时期的观点相一致。

2.3 FCM方法检测乳酸菌自溶度的准确性验证

对10份菌悬液分别使用FCM方法、平板计数法和比浊法进行自溶度检验，检测结果如图2示，乳酸菌菌悬液上机样本的细胞数在104cells/mL－107cells/mL范围内时，FCM法所得结果与平板计数法和比浊法的检测结果均呈正相关，相关性系数为p<0.01r=0.9805和p<0.01r=0.9249，结果均为显著。

图2 FCM法与其他自溶度检测方法的相关性

与传统方法相比，FCM方法检测乳酸菌自溶度具有诸多优势。平板计数法耗时长(通常需要24－72h)，数据离散程度高，变异系数CV值达到10%－25%。在本研究中发现，同时使用平板计数法和FCM方法检测相同菌液，平板计数法测得活菌数比FCM法测得的活菌数低，可见菌落生长过程中易受许多外界因素影响，有时并不能准确地反映菌液中活菌数的比例关系。与之相比，FCM方法取样和染色操作简便、耗时短，完成整个检测过程仅需1h左后即可获得准确可靠的数据，可以实时监测乳酸菌在生长过程的自溶度变化。同样的，使用分光光度法测量菌悬液的吸光值时，样液中菌体浓度太大或太小可造成吸光度过高或过低，若培养基含有颗粒或细胞碎片等杂质干扰时，其测量误差非常大。而流式细胞仪则是在封闭的环境中对单个细胞进行逐一检测，排除了很多干扰因素。由此可见，FCM方法所得结果的精确度和直观程度远高于传统菌落计数法和菌液比浊法。

3 结语

流式细胞术(FCM)集流体喷射、激光、电子和计算机技术等于一体，是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，它可高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多种参数，与传统检测方法相比，具有简单、快速和敏感性高等优点，可进行活体细胞的多参数分析。在细胞浓度范围104cells/mL－107cells/mL内，采用PI染色的FCM方法能够将乳酸菌自溶和未自溶的细胞在FCM图谱上清楚地区分开来，并且能正确反映其比例关系，该方法快速、稳定、可靠，很好的满足了乳酸菌自溶度检测的需要。

参考文献:

[1]李培援,唐国山.XL型流式细胞仪的原理及常见故障检修[J].医疗设备信息,2006,21(1):86.