冻融次数对牦牛肉蛋白质氧化性和抗氧化性的影响

冻融次数 对牦牛肉蛋白质氧化性和抗氧化性的影响

陈倩红

酒钢集团甘肃 祁牧乳业有限责任公司，甘肃，嘉峪关， 735100

摘要：为了探究不同冻融次数对牦牛肉蛋白质氧化性和抗氧化性的影响。本研究选取牦牛背最长肌，经过7次冻融循环，分别测定样品的羰基含量、总巯基含量、总酚含量、自由基清除能力（RSA）、生育酚当量抗氧化能力（TEAC）。结果表明，随着冻融次数的增加，牦牛肉蛋白质羰基含量显著增加（P<0.05），巯基含量、总酚含量显著降低（P<0.05），自由基清除能力（RSA）、生育酚当量抗氧化能力（TEAC）显著减弱（P<0.05），牦牛肉蛋白质氧化性和抗氧化性之间呈负相关。表明多次冻融循环会引起牦牛肉蛋白质抗氧化能力显著减弱，造成氧化程度显著升高。因此，保证牦牛肉在运输过程中的恒温，对减少蛋白氧化并提高抗氧化性对保护牛肉品质具有重要意义。

关键词：牦牛肉；冻融循环；蛋白质氧化性；抗氧化性

前言

牦牛饲养方式为放牧，一年四季以天然牧草为食，造就了其高蛋白、低脂肪的特性，同时其富含类胡萝卜素、氨基酸、钙、磷等等多种营养成分，被称为“牛肉之冠”^[1]。但由于牦牛主要分布在我国以青藏高原为中心的高山地区^[2]，受高原气候和交通的影响，冻藏成为其胴体最重要的贮藏方式^[3]。然而，在运输、贮藏、销售等环节中温度的变化会使其在被食用前反复处于冻结和解冻(冻融循环)的过程影响品质。此外，肌细胞会伴随着冻融次数增加，发生破裂使酶释放到肌浆中，从而加快蛋白质氧化^[4]，使肉的品质发生较大的改变，不仅降低消费者体验感，同时影响企业的经济效益。

因此，本试验对选取的牦牛肉进行冻融循环处理，然后测定其总酚含量、自由基清除能力、生育酚当量抗氧化能力羰基含量以及巯基含量等品质指标，旨在研究反复冻融对贮藏、运输、销售过程中牦牛肉蛋白质氧化和抗氧化性的影响，为在产业化生产过程中提高牦牛肉蛋白质抗氧化性并有效控制蛋白质氧化提供有力的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料：牦牛背最长肌

1. 1. 1. 试验试剂

盐酸胍；二硝基苯肼；尿素；二硝基苯甲酸(DTNB)、分离缓冲液(0.1mol/L NaCl，10mmol/L Na₃PO₄，2mmol/L MgCl₂，1mmol/L EGTA，pH=7.0)；三氯乙酸(TCA)；乙醇-乙酸乙酯；Folin-Ciocalteau试剂；碳酸钠；ABTS；过硫酸钾等。试验试剂均为分析纯。

1.1.2 仪器与设备

TGL-20M高速台式冷冻离心机；XHF-D高速分散器（内切式匀浆机）；754PC型紫外可见分光光度计；PHS-3C型pH计；QL-866旋涡混合器；恒温槽；超声破碎仪

1.2 方法

1.2.1 样品处理

牦牛屠宰后立即取其背最长肌，剔除肉表面的筋、腱、膜及脂肪后，将肉样切成质量100g左右的肉块，用聚乙烯食品保鲜袋包装，装入放有冰袋的保温箱中运回实验室。样品随机分为8组，每组3份平行，分别为冻融0、1、2、3、4、5、6、7次。样品循环冻融条件为在-18℃冷冻，4℃解冻12h，每一周冻融一次。

1.2.2 肌原纤维蛋白的制备

参照陈茜茜^[4]的方法。将分离缓冲液(10mmol/L Na₃PO₄，0.1mol/L NaCl，2mmol/L MgCl₂1mmol/L EGTA，pH=7.0)与绞碎的肉块以体积比4:1混合匀浆后离心(4℃，15 min，2000×g)，得到的沉淀重复洗涤，离心两次。然后再按上述操作用四倍体积0.1mol/L NaCl溶液洗涤，离心两次，在最后一次离心前用三层纱布过滤，然后用0.1mol/L 盐酸溶液将其pH值调到6.0，得到的即为肌原纤维蛋白并于‐20℃冷冻储藏。用考马斯亮蓝法对肌原纤维蛋白浓度进行测定，采用牛血清蛋白为标准蛋白。

1.2.3 羰基含量测定

参照姜晴晴^[5]的方法。在离心管（1.5mL）中加入含0.5mL 0.02mol/L 2,4-二硝基苯肼的2mol/L HCl溶液与0.1mL的蛋白液，在25℃条件下反应40min，并以加入0.5mL不含2,4-二硝基苯肼的2mol/L HCl溶液作为空白样品。随后在上述离心管中分别加入质量分数为20%的三氯乙酸(TCA)0.5mL，振荡后离心(5min，11000×g，4℃)弃上清液，用1mL体积比为1:1的乙醇-乙酸乙酯溶液洗涤蛋白质沉淀三次，用1mL 6 mol/L盐酸胍溶液将挥发完溶剂后的蛋白质悬浮，水浴30min（37℃条件下)。将空白作为对照在λ_370nm下测吸光值，使用摩尔吸光系数为 22000M^-1cm^-1计算蛋白质羰基衍生物的含量（nmol/mg蛋白质）。每组样品分别测量3个平行，结果取平均值。

羰基含量计算公式：

式中：A表示370nm波长处的吸光度；n表示稀释倍数；Ɛ表示摩尔吸光系数22000/(L/(mol•cm))；ρ表示蛋白质质量浓度(mg/mL)。

1.2.4 总巯基含量测定

参考李银等^[8]的方法。将稀释蛋白液至2mg/mL，按1:1比例与尿素缓冲液溶解，孵育后加入0.5mL 二硝基苯甲酸试剂，在室温下反应15min，在λ_412nm处测吸光度。空白组加入0.5mL不含二硝基苯甲酸的缓冲液。使用摩尔吸光系数11400 M^-1cm^-1计算巯基含量(nmol/mg蛋白质)。每组样品分别测量3个平行，结果取平均值。

巯基含量计算公式：

式中:A表示412nm波长处的吸光度；n表示稀释倍数；Ɛ表示摩尔吸光系数11400 M^-1cm^-1；ρ表示蛋白质质量浓度(mg/mL)。

1.2.5 牦牛肉提取物制备

参考陈骋^[2]等的研究方法。切取牦牛肉30g置于绞肉机中绞碎、混匀，称取2g于研钵加入40mL蒸馏水快速研磨，随后用超声波破碎仪进行超声破碎处理（总时间：6min，超声处理3s，间隔：2s，功率：31%），所得产物离心（3000×g、4℃、15min）后过滤取上清液，即为牦牛肉提取物。

1.2.6 总酚含量的测定

参考马骋^[9]的研究方法。取1.2.5制备牦牛肉提取物500uL蒸馏水1:1混合，再加入浓度为1N的Folin-Ciocalteau试剂500uL，静置1min后加入2.5mL质量分数为20%碳酸钠溶液均匀混合，接着在25℃条件下避光水浴40min，最后离心（2700×g、4℃、15min）消除弃碳酸钠沉淀，空白组以不含肌肉提取物的Folin-Ciocalteau试剂稀释液，在λ_760nm波长下读取吸光度。

标 准曲线制备：分别制备0.0、20.0、40.0、60.0、80.0、100.0、120.0ug/mL单宁酸水溶液，分别吸取500uL单宁水溶液加入同体积的蒸馏水，再加入浓度为1N的Folin-Ciocalteau试剂500uL，重复上述操作，制作标准曲线，用毫克单宁酸当量（TAE）/克肌肉表示总酚含量。

图1 总酚含量标准曲线

1.2.7 自由基清除能力（RSA）的测定

参考李若绮^[10]的研究方法。ABTS反应液的制备：在黑暗条件下25ml，14mmolABTS和等体积4.9mmol的K₂S₂O₈混合于试管中并反应16h。使用时ABTS反应液用磷酸盐缓冲液（pH=7.4）稀释令其在λ_734nm的吸光度在0.750±0.020。将4.0mL的ABTS反应液加到40uL牛肉提取物中，随后在30℃条件下水浴6min，空白组为加入4.0mL的ABTS反应液到40uL的蒸馏水中，在λ_734nm波长下测定吸光度，抑制率按以下公式计算：

式中A0-Bl为空白的吸光度，A6为样品的吸光度。

1.2.8 生育酚当量抗氧化能力（TEAC）的测定

参考李若绮^[10]的研究方法，并稍作修改。ABTS反应液的制备（方法参照1.4.3）40uL牛肉提取物中加入4.0mL的ABTS反应液，然后在30℃下水浴6min，用40uL的蒸馏水中加入4.0mL的ABTS反应液作为空白，在λ_734nm波长下测定吸光度。

标准曲线制备：制备0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mmol/L不同浓度的生育酚水溶液，依次吸取40uL生育酚溶液加入ABTS反应液4.0mL，随后在30℃条件下水浴6min，并在λ_734nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线，用umol TE/g肌肉表示TEAC值。

图2 TEAC标准曲线

2 结果与分析

2.1 冻融次数对牦牛肉蛋白质氧化性的影响

2.1.1 冻融次数对牦牛肉羰基含量的影响

蛋白质氧化会引起肽主链的断裂，氨基酸残基侧链的氧化修饰（羰基化、轻基化等）形成蛋白质氧化产物^[7]，因此，通过测定牦牛肉在冻融循环过程中羰基含量的高低，可反映不同冻融次数下牦牛肉蛋白质氧化程度。从图3可以看出，随着冻融次数的增加，牦牛肉蛋白质羰基含量显著增加（P<0.05）。

图3 冻融次数对牦牛肉羰基含量的影响

注：标有不同字母者表示差异显著（P<0.05），标有相同字母者表示差异不显著（P>0.05），下同。

2.1.2 冻融次数对牦牛肉巯基含量的影响

图4 冻融次数对牦牛肉巯基含量的影响

蛋白质空间结构的伸展会造成巯基含量的显著降低^[10]。从而可以用巯基含量来反映蛋白质的氧化程度^[11]。由图4可知，牦牛肉中蛋白质巯基含量随冻融次数的增加显著降低（P<0.05）。同时从本试验结果可以看出，经过3次冻融的牦牛肉巯基含量降低了6.38%，后期冻融过程中，巯基含量降低了20.03%，表明前期冻融循环巯基含量明显低于后期，说明冻融循环后期的氧化速率高于前期氧化速率。

2.2 冻融次数对牦牛肉蛋白质抗氧化性的影响

2.2.1 总酚含量的测定

图5 冻融次数对牦牛肉总酚含量的影响

酚类化合物苯环上的羟基易失电子形成较稳定的酚类游离基中间体，该中间体不会引发新的游离基也不会被迅速氧化^[10]，因此，牦牛肉抗氧化的程度可以通过总酚的量化来评估。来由图5可知，牦牛肉中蛋白质总酚含量随冻融次数的增加显著降低（P<0.05）。结果表明，随着冻融次数的增加，牦牛肉蛋白质的抗氧化能力减弱。

2.2.2 自由基清除能力（RSA）的测定

图6 冻融次数对牦牛肉自由基清除能力（RSA）的影响

RSA反映肌肉组织所有抗氧化物质组成的抗氧系统对自由基的清除能力。由图6可知，在没有冻融时，自由基的清除率达33.3%，第7次冻融循环后，自由基的清除率降至19.0%，在第0~3次和第4~7次冻融循环过程中，自由基清除率均显著降低（P<0.05），且前期降低了5.8%，后期降低了8.5%。表明前期冻融循环自由基清除能力明显高于后期，说明冻融循环后期的抗氧化速率低于前期抗氧化速率。

2.2.3 生育酚当量抗氧化能力（TEAC）的测定

图7 冻融次数对牦牛肉生育酚当量抗氧化能力（TEAC）的影响

生育酚是牛肉中维生素E的水解产物，是主要的抗氧化物质之一，因此，蛋白质的抗氧化能力可以用生育酚当量来评估。由图7可知，牦牛肉中生育酚当量随冻融次数的增加显著降低（P<0.05）。同时，第6、7次冻融时生育酚当量快速减少，说明在成熟期间能够有效清除自由基的生育酚含量逐渐减少，这可能是导致2.2.2中牦牛肉RSA降低的原因之一。

3 结论

随着冻融次数的增加，牦牛肉氧化程度显著增加，抗氧化能力呈现显著下降。且牦牛肉蛋白质氧化和抗氧化之间呈负相关，在7次冻融过程中，抗氧化能力变化趋势与氧化性变化趋势相反，并且后期抗氧化下降速率减缓的同时蛋白质氧化速率上升。表明多次冻融循环会引起牦牛肉蛋白质氧化程度显著升高，造成抗氧化性显著下降，因此，可通过有效控制贮运体系中蛋白质氧化和提高抗氧化能力来更好的保持牦牛肉品质。

参考文献

[1]陈骋,韩玲,余群力,张巨会. 冻融对牦牛肉色、微观结构和蛋白质降解的影响[J]. 农业机械学报,2015,(10):290-297.

[2]杨斌,陈峰,魏彦杰,卢秀彬. 牦牛肉加工与发展现状[J]. 肉类研究,2010,(06):3-5.

[3]黄鸿兵. 冷冻及冻藏对猪肉冰晶形态及理化品质的影响[D]. 南京：南京农业大学, 2005.

[4]陈茜茜,黄明,邹玉峰,徐幸莲,周光宏. 辐照和反复冻融对牛肉蛋白质氧化及食用品质的影响[J]. 食品科学,2014,(19):1-5.

[5]姜晴晴. 冻融过程中带鱼脂肪和蛋白氧化及其对肌肉品质影响的研究[D].浙江大学,2015.

[6]李银,李侠,张春晖,孙红梅,董宪兵. 羟自由基导致肉类肌原纤维蛋白氧化和凝胶性降低[J]. 农业工程学报,2013,(12):286-292.

[7]马骋. 不同含氧气调包装方式对牦牛肉保鲜效果和肉色稳定性的影响[D].甘肃农业大学,2016.

[8]李若绮. 宰后冷藏过程中牛肉肉用品质变化及抗氧化物质对肉色稳定性影响[D].甘肃农业大学,2015.

[9]李婉竹,梁琪,张炎,文鹏程. 不同冻融次数下牦牛肉蛋白质氧化与保水性的关系[J]. 食品科学,,:1-8.

[10]李儒仁,韩玲,余群力,荣良燕,李洪波. 冻藏对牦牛肉蛋白质、脂质氧化和保水性的影响[J]. 农业机械学报,2015,(06):218-225.

[11]李金平,李春保,徐幸莲,周光宏.反复冻融对牛外脊肉品质的影响[J]. 江苏农业学报,2010,(02):406-410.

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