国家食品卫生标准大肠菌群检验方法探究

国家食品卫生标准大肠菌群检验方法探究

段艳飞

云南孚尔质量检验检测有限公司

摘要：本文主要分析和探讨国家食品卫生微生物标准的大肠杆菌群测定的基本原理和具体方法，并针对现有检测方法的不足提出有针对性的完善意见，希望可以促进大肠菌群检测技术的不断进步。

关键词：大肠菌群；检验方法；修改建议

大肠菌群只存在于温血动物和人的肠道中，来源非常专一，并且在粪便中含量较多，对外部环境的耐受性也较高。大肠菌群是世界上绝大多数国家和组织评价食品卫生质量的重要指标。我国的食品卫生微生物标准体系主要包括大肠菌群、菌落总数以及致病菌三大类，其中大肠菌群既属于菌落总数的一部分，同时作为粪便污染指示菌，与肠道致病菌之间存在着密切联系，所以大肠菌群在食品微生物指标体系中地位显著。

1. 大肠菌群及其检验意义

大肠菌群大量存在于人和动物的肠道内，并且在水分和营养物质充足的环境中能够长时间生存，大肠菌群的生长对营养物质的要求较低，能够在含有适宜浓度胆盐的培养基中生存。大肠菌群能够产生发酵乳糖，并产生酸和气体。大肠菌群不具备耐高温的特性，在巴氏杀菌条件下会很快死亡，而且在寒冷环境中也不易存活，所以冷冻食品中的大肠菌群含量极低。

（一）大肠菌群及其检验意义

大肠菌群是指在37℃的环境中，在24小时之内能够发酵乳糖并产酸产气的革兰氏阴性无芽孢杆菌。检测食品中大肠菌群的含量，就可以判断出食品被粪便的污染程度，同时也能反映出食品对人体健康的危害性。粪便内不仅包含了正常细菌，同时也会存在着一些肠道致病菌，例如志贺氏菌、沙门氏菌等。如果食品在生产过程中被粪便污染，那么食品就有很大可能会携带肠道致病菌，进而引起食物中毒或者流行性疾病，因此对于大肠菌群进行检验有着十分重要的意义。

（二）大肠菌群的相关标准

大肠菌群作为检验食物粪便污染的指标，因为大肠菌群更容易分离和鉴定，现如今已经广泛应用在食品检测领域。由于世界上不同国家的食品种类不同，而且对于粪便指示菌的认识也存在一定差异，所以在选择粪便污染指示菌时也存在着很大不同，但是通常多以大肠菌群、粪大肠菌群、粪链球菌等作为粪指示菌。

二、大肠菌群检验原理、方法和应用范围

（一）大肠菌群的检验原理和检验程序

在GB/T 4789.3-2003中规定了大肠菌群检验的具体程序，包括乳糖发酵实验、EMB分离培养和确证实验三步，并且根据确证试验的阳性管数的对应MPN检索表得到大肠菌群最可能数也就是MPN值。

乳糖发酵实验，需要利用胆盐从复杂的食品微生物区系中将大肠菌群分离出来，并用溴甲酚紫和杜汉氏小管显示出具体的产酸产气发酵效果，由于选择性试剂胆盐具有一定的局限性，一些非大肠菌群也可能产生产酸产气现象，因此需要利用EMB培养皿将典型的发酵乳酸菌落进行分离，并通过确证试验提高菌源。然后一方面通过纯培养复发酵证实其是否为发酵乳糖，另一方面通过革兰氏染色证实其是否为革兰氏阴性无芽孢小杆菌，只有同时满足上述两个条件才能确认该发酵管为阳性。

（二）大肠菌群的限量标准和应用范围

作为卫生微生物指标，大肠菌群几乎适用于所有食品卫生检测中心。根据卫生部颁布的食品卫生国家标准，我国食品中的大肠菌群限量标准有30MPN/100ml(g)和3MPN/100ml(g)两个水平。根据表1大肠菌群最可能数（MPN）检索表，也就是9管法，只有当1、0.1、0.01ml(g)的3个连续稀释度的9支乳糖发酵管全部呈现阴性时，才符合小于30MPN/100ml(g)这一限量标准；同样只有满足0.1、0.01、0.001ml(g)的3个连续稀释度的9支乳糖发酵管全部为阴性时，才符合3MPN/100ml(g)这一限量标准。

表1大肠菌群最可能数（MPN）检索表（9管法）

表2不同管数进行稀释时的不同阳性组合的MPN指数和95%可信限

三、大肠菌群检测方法与检测标准之间的缺陷和不足

如表1所示，在我国的食品卫生标准中对于部分食品要求大肠菌群的限量为3MPN/100ml(g)，但是表1的最小检出限为30MPN/100ml(g)，所以必须选择10、1、0.1ml(g)才更具有检验意义。而且在国标GB/T 4789.3-2003中要求如果大肠菌群的接种量大于1ml的，需要用双料乳糖胆盐发酵管，接种量小于等于1ml的，需要使用单料乳糖胆盐发酵管，对于接种量为10ml的，在国标中尚未提及。如果是液体检样，则直接抽取10毫升样品加入双料乳糖胆盐发酵管中即可；如果检样为固体，则可以将1g检样进行1:10稀释，得到10毫升稀释液，但是在国标中没有明确规定如何将10g固体检样接种到乳糖胆盐发酵管中。如果将10g检样直接接种到乳糖胆盐发酵管中，在没有经过稀释处理的前提下，大肠菌群在检样中分布并不均匀，这会导致检测误差；如果需要稀释后接种，那么稀释容量达到100ml(g)，根本无法进行试验。

从表2可以看出，当大肠菌群检验采用1、0.1、0.01ml(g)时，最小的检出限量为30MPN/100ml(g)，而瓶装纯净饮用水、食醋、发酵酒的卫生标准必须满足小于等于3MPN/100ml(g)，所以对此类产品进行大肠菌群检验时必须采用10、1、0.1ml(g)才具有检验意义。在进行大肠菌群检验时，接种量为10ml的必须用双料乳糖胆盐发酵管，否则会影响培养基的初发酵效果，其余两款则需要采用单料乳糖胆盐发酵管。而且通过表2中我们还可以得到这样的结论：只有当3支管全部为阴性（0-0-0），或者只有0.1ml的管为阳性（0-0-1），或者只有1ml的管为阳性（0-1-0）时，才能判断出食品中的大肠菌群含量小于等于3MPN/100ml(g)，才符合食品卫生标准。而后两者的95%可信限分别为0.5-9MPN/100ml和0.5-13MPN/100ml，这也说明仍然存在着超过3MPN/100ml(g)的概率，所以只有当3支管全部为阴性，才能确保检测结果真正符合卫生标准。

四、大肠菌群检验方法及检验标准的修改建议

相比于国标法，15管法对于大肠菌群检验具有更高的精度。15管法的原理同9管法类似，只是将每个稀释度的接种乳糖胆盐发酵管增加到5只，符合卫生标准的阳性组合也从9管法的3种上升到15管法的4种，因此具有更高的可信度。在检测发酵酒、瓶装纯净与用水、食醋与乳酸菌饮料等的检测中作用明显。

除此之外，国家食品卫生标准对于一些要求较高的食品规定样品接种量必须达到10ml(g)，并且使用双料乳糖胆盐发酵管，但是却没有明确指出，如何将样品接种到培养基上，因此会检验操作者带来一定的操作难度，同时也会对检测带来影响，为了最大程度的保证检测结果的准确性，因此可以使用大容量的双料乳糖胆盐发酵管，例如30毫升，进行发酵实验，前提是要保证检验样品具有一致性。

传统的检测大肠菌群的方法往往具有实验量大，步骤复杂，费时费力，检出限地、灵敏度差以及成本高等缺点，对于某些快速消费的食品，往往不能够及时的产生检测结果，具有滞后性，对企业造成巨大的经济损失，在一定程度上阻碍了食品卫生学检测。而近年来发展的现代方法虽然解决了时间问题，但是方法并未得到完善全面的发展，检测结果会受到假阳性的干扰，并且这些方法的成本都比较昂贵，不适用于基层实验室的使用。因此，随着食品行业对食品的卫生质量要求越发严格，迫切需要一种能够实现快速、准确、便捷地检测出食品中的大肠菌群的方法。

综上所述，作为人进行生命活动和进步的最根本的物质条件，食品有着举足轻重的作用，食品安全是食品中最重要的一个因素。近年来，由于人们过分追求经济效益，导致了食品最基本的安全问题被忽视，食品安全事件频发，已经成为亟待解决的问题。食品微生物污染是食品安全问题中最主要的污染因素。我国对食品中微生物的检测主要包括菌落总数、大肠菌群和致病菌的检测，其中，大肠菌群作为判断食品是否受粪便污染和肠道病原菌污染的指示菌，在评价食品卫生质量中有重要意义。

参考文献：

[1], 检验检测工作　质量检验检测. 周宗青 主编,莒南年鉴,吉林文史出版社,2019,190-191,年鉴.

[2], 第三章 卫生防疫　第二节 食品、药品和饮用水卫生安全管理. 王明英,彭志刚,肖静,龚军,邹远骏,王锐 主编,汶川特大地震德阳市旌阳区抗震救灾志,开明出版社,2008-2011,167-169,年鉴.