成都蓉生药业有限责任公司
【摘要】目的根据验证计划安排，需通过本次验证制剂室人免疫球蛋白生产用超滤系统符合人免疫球蛋白生产工艺要求，生产前、后手工清洗程序的清洗效果是否符合产品工艺要求，并建立证明性文件。方法确认超滤系统按清洗程序清洗后的清洗效果是否符合工艺要求，并确认生产前清洗有效期和生产后待清洗保留时间。结果超滤系统生产前、后清洗效果符合要求，生产前清洗有效期经确认为清洗后保持5h，生产后待清洗保留时间为1.5h。
【关键词】超滤系统；超滤膜；细菌内毒素
1 概论
超滤系统是企业生产过程中药物浓缩、配制过程的重要设备之一。本超滤系统是依据国家《药品生产质量管理规范》及现行相关规范和标准进行设计、制造和安装[1]。
1.1设备
表1制剂室人免疫球蛋白生产用超滤系统基本信息一览表
被验证对象名称 | 免疫球蛋白生产用超滤系统 | ||
生产厂家 | MILLIPORE | 超滤系统膜面积 | 40m2 |
被验证对象用途 | 用于人免疫球蛋白透析浓缩 | | |
2.1验证方式
由于该系统为首次验证，效期确认需重复进行三次试验[2]，包括：超滤系统生产前、后清洗效果确认及生产前清洗有效期确认和生产后待清洗保留时间确认。
2.2清洁验证风险分析
2.2.1被清洁对象代表选择风险分析
表2被清洁对象代表选择风险分析
清洗程序名称 | 清洗 | 被清洗对象 | 各验证项目验证代表选择 | 选择（未选择）理由 | |||||||
目测检查 | 清洗覆盖率确认 | 难清洗物质（蛋白）残留水平测定 | 实际清洗效果确认 | 待清洁保留时间确认 | 清洗后有效期确认 | ||||||
淋洗水取样检测确认 | 表面擦拭取样 确认 | 表面微生物 确认 | |||||||||
前清洗程序：1.排空碱液：排空超滤器及碱罐中的的碱液；2.使用注射用水对超滤器的膜上，膜下进行冲洗。 | 超滤器 | 超滤膜及超滤系统管道内表面 | | | | √ | | | | √ |
|
后清洗程序：1. 使用注射用水对超滤器膜上膜下冲洗；2. 使用0.5M碱液循环超滤器；3. 排空0.5M的碱液后，使用注射用水对超滤器膜上膜下冲洗；4. 使用0.1M碱液封存超滤器。 | 超滤器 | 超滤膜及超滤系统管道内表面 | | | | √ | | | √ | | |
2.2.2最难清洗物质及残留风险分析
表3最难清洗物质及残留风险分析
接触物料名称 | 最难清洗物质 | 最难清洗理由 | 残留检测方法 | 验证/控制措施 |
人免疫球蛋白原液 | 残留蛋白 | 超滤过程中，人免疫球蛋白可能发生降解或变性聚合，生成蛋白碎片或多聚体，容易吸附在膜孔和系统内壁，难以清除。 | 总有机碳TOC检测法 | 实际清洗效果确认 （淋洗水水质检测） |
2.2.3最难清洗部位及取样风险分析
表4最难清洗部位及取样风险分析
部件名称 | 药品接触部位 | 最难清洗部位 | 最难清洗理由 | 取样方法 | 验证/控制措施 |
人免疫球蛋白超滤系统 | 超滤膜切向面及超滤系统管道内表面 | 超滤膜包内部的折叠滤膜 | 超滤膜包内部的折叠滤膜处，水冲洗的力度较小，不易清洗 | 淋洗水取样法 | 实际清洗效果确认（淋洗水水质检测） |
2.2.4清洁剂残留风险分析
表5清洁剂残留风险分析
清洁剂名称 | 残留超标导致的后果 | 检测方法 | 验证/控制措施 |
0.1mol/L NaOH溶液 | 可能导致制品pH变化 | pH检测 电导率检测 | 实际清洗效果确认（检测淋洗水的pH值、电导率） |
2.3验证检测项目风险分析
表6验证检测项目风险分析
检测项目 | 选择理由 | 取样方法 | 检测方法 | 验证/控制措施及测试阶段 |
pH | 通过残留样品的pH值可反映能因清洗不彻底而造成的碱性清洁剂（0.1mol/L NaOH溶液的）残留 | 淋洗水取样法 | 控制待检样品温度在23-25℃，使用pH计检测 | 生产前清洗效果确认 |
总有机碳TOC | 通过残留样品的TOC检测结果可反应因清洗不彻底而残留的蛋白质及其他有机残留物 | 淋洗水取样法 | 待总有机碳分析仪预热0.5h以上，再使用仪器检测样品 | 前清洗时；后清洗时 |
电导率 | 通过残留样品的电导率检测结果可反映因清洗不彻底而残留的金属离子及无机盐类 | 淋洗水取样法 | 使用电导仪检测 | 前清洗时 |
细菌内毒素 | 通过残留样品的细菌内毒素检测结果可反映因清洗不彻底而可能存在内毒素物质 | 淋洗水取样法 | 使用凝胶法检测内毒素 | 前清洗时；后清洗时 |
微生物限度 | 通过残留样品的微生物检测结果可反映因清洗不彻底而可能存在于设备内表面的微生物 | 淋洗水取样法 | 使用薄膜过滤法检测微生物限度 | 前清洗时；后清洗时 |
2.3被清洗对象内表面积和残留限度标准计算
根据PIC/S-GMP指南第二部分(原料药基本要求)中“12.7清洁验证”章节中规定，公司所有直接接触制品的设备及生产用具允许的蛋白残留限度为2.52μg/cm2。采用TOC检测方法分析残留量，按照蛋白残留物中的总有机碳含量为50%计算，则TOC残留限度标准为1.26μg/cm2。
根据产品清洁验证残留物限度确认，根据不同的取样方法及不同设备和生产用具的内表面积计算各个制品罐清洁验证样品检测结果的TOC残留可接受标准。计算公式如下：
淋洗水取样法样品检测结果的TOC残留可接受标准为：
样品TOC背景值测定及样品实际TOC残留量计算
淋洗水取样法：淋洗用注射用水的TOC检测值含各样品TOC背景值，则按照下式计算各淋洗水样品的实际TOC残留量：
淋洗水样品实际TOC值（TOC残留量）= 样品TOC检测结果– 样品TOC背景值（淋洗用注射用水的TOC检测值）。
取样点、取样方法及可接受标准见下表。
表7取样点、取样方法及可接受标准
| 清洗对象信息 | 清洁验证样品检测结果的TOC残留可接受标准计算 | ||||||
清洗程序 | 清洗对象 | 设备 材质 | 直接接触制品部位 | 最难清洁部位（擦拭取样部位） | 接触制品属性 | 被清洗内表面积（m2） | 淋洗水量（L） | 样品TOC残留可接受标准（ppb） |
生产前清洗 | 人免疫球蛋白超滤系统 | 聚醚砜、PVC、316L不锈钢 | 超滤膜切向面（40m2）及超滤系统管道内表面（10m2） | 超滤膜包内部的折叠滤膜 | 人免疫球蛋白 | 50 | 100 | 6300 |
生产后清洗 | ||||||||
3.1超滤系统生产前实际清洗效果确认
确认新安装的超滤膜堆在投入生产前按照实际清洗程序完成清洗后，其清洗效果在清洗有效期内能否达到人免疫球蛋白超滤生产工艺要求。
3.1.1超滤系统生产前清洗程序
3.1.1.1清洗程序：1.排空碱液：排空超滤器及碱罐中的的碱液；2.使用注射用水对超滤器的膜上，膜下进行冲洗。
3.1.1.2取样方法及检测项目
生产前清洗结束后，对超滤系统内最终淋洗水分别取样，检测系统淋洗水的pH值、电导率、TOC含量、微生物限度以及细菌内毒素含量[3]。
生产前清洗取样点、取样方法及可接受标准见下表。
表8取样方法及可接受标准
被清洗设备 | 淋洗水量（L） | 检测项目 | 取样送样量 | 可接受标准 |
人免疫球蛋白超滤系统 | 100 | 淋洗水pH | 800ml | 符合《中国药典》2020版注射用水标准要求（即pH值在5.0~7.0） |
淋洗水电导率 | 符合《中国药典》2020版注射用水标准要求,即电导率≤1.3μS/cm（25℃） | |||
淋洗水细菌内毒素 | 20ml | ＜0.25EU/ml | ||
淋洗水微生物限度 | 200ml | 淋洗水样品的需氧菌总数应不高于10CFU/100ml | ||
淋洗水TOC残留量 | 40ml( TOC专用取样瓶 | 林洗水样品TOC值≤500ppb |
3.2超滤系统生产前清洗有效期确认
确认在实际生产前超滤系统按规定的清洗程序进行清洗后，其清洗效果在清洗有效期内能否达到人免疫球蛋白超滤生产工艺要求。实际生产中超滤系统后清洗结束后均用0.1mol/LNaOH溶液循环保存，且在生产前进行前清洗，故不需要对其后清洗的有效期进行验证。
3.2.1 方法
3.2.1.1 超滤系统前清洗完成后，分别放置5小时和7小时后采用淋洗水取样法（淋洗水量100L）对超滤系统进行取样，检测系统淋洗水样品的微生物限度和细菌内毒素含量。
3.2.2.2 生产前清洗有效期的确定：以淋洗水样回流液的细菌内毒素和微生物限量均合格的最长放置时间减去2小时为超滤系统前清洗后存放有效期。
3.2.1可接受标准
林洗水细菌内毒素＜0.25EU/ml、淋洗水样品的需氧菌总数应不高于10CFU/100ml
3.3超滤系统生产后清洗效果及待清洗保留时间确认（同步验证）
实际生产后，超滤系统应立即按规定的清洗程序进行清洗。为了验证最差条件下的清洗效果[4]，超滤系统在实际生产完毕后，保留两小时后再按规定的清洗程序进行清洗后，确认其清洗效果能否达到人免疫球蛋白超滤生产工艺要求。
3.3.1 方法
3.3.1.1超滤系统在生产结束后，保留2小时
3.3.1.2使用注射用水对超滤器膜上膜下冲洗。
3.3.1.3使用0.5M碱液循环超滤器。
3.3.1.4排空0.5M的碱液后，使用注射用水对超滤器膜上膜下冲洗。
3.3.1.5使用0.1M碱液封存超滤器。
3.2.1.6待清洗保留时间的确定：以生产后保留2小时再进行清洗后的最终淋洗水样的细菌内毒素和微生物限量均合格的最长保留时间减去0.5小时为超滤系统待清洗保留时间。
3.3.1取样方法及检测项目
清洗结束后，采用淋洗水取样法（淋洗水量100L）对超滤系统内表面分别取样，检测系统淋洗水的pH值、电导率、TOC含量、微生物限度以及细菌内毒素含量。
3.3.2超滤系统生产后清洗效果确认取样点、取样方法及可接受标准
表9超滤系统生产后清洗效果及待清洗保留时间确认取样点、取样方法及可接受标准
被清洗设备 | 淋洗水量（L） | 检测项目 | 取样送样量 | 可接受标准 |
人免疫球蛋白超滤系统 | 100 | 淋洗水pH | 800ml | 符合《中国药典》2020版注射用水标准要求（即pH值在5.0~7.0） |
淋洗水电导率 | 符合《中国药典》2020版注射用水标准要求,即电导率≤1.3μS/cm（25℃） | |||
淋洗水细菌内毒素 | 20ml | ＜0.25EU/ml | ||
淋洗水微生物限度 | 200ml | 淋洗水样品的需氧菌总数应不高于10CFU/100ml | ||
淋洗水TOC残留量 | 40ml( TOC专用取样瓶 | 林洗水样品TOC值≤500ppb |
4 验证结果
表10超滤系统生产前清洗效果确认结果
确认项目 | 确认结果 | |||
第一次 | 第二次 | 第三次 | ||
淋洗水pH | 6.2（21.6℃） | 5.8（19.5℃） | 6.0（20.3℃） | |
淋洗水电导率 | 0.3μS/cm（21℃） | 0.6μS/cm（20℃） | 0.4μS/cm（20℃） | |
淋洗水细菌内毒素 | ＜0.25EU/ml | ＜0.25EU/ml | ＜0.25EU/ml | |
淋洗水微生物限度 | ＜1CFU/100ml | ＜1CFU/100ml | ＜1CFU/100ml | |
淋洗水TOC残留量 | 背景值 | 27 ppb | 29 ppb | 47 ppb |
测量值 | 27 ppb | 53 ppb | 85 ppb | |
实测值 | 0 ppb | 24 ppb | 38 ppb | |
结论 | 三次验证结果均满足要求 | |||
表11超滤系统生产前清洗有效期确认结果
试验频次 | 放置时长 | 结果 | |
淋洗水细菌内毒素 | 淋洗水微生物限度 | ||
第一次 | 5H | ＜0.25EU/ml | ＜1CFU/100ml |
7H | ＜0.25EU/ml | ＜1CFU/100ml | |
第二次 | 5H | ＜0.25EU/ml | ＜1CFU/100ml |
7H | ＜0.25EU/ml | ＜1CFU/100ml | |
第三次 | 5H | ＜0.25EU/ml | ＜1CFU/100ml |
7H | ＜0.25EU/ml | ＜1CFU/100ml | |
结论 | 三次验证淋洗水样回流液的细菌内毒素和微生物限量均合格的最长放置时间减去2小时为超滤系统前清洗后存放有效期，即超滤器清洗有效期为5小时。 | ||
4.3超滤系统生产后清洗效果确认结果
表12超滤系统生产后清洗效果及待清洗保留时间确认结果
确认项目 | 确认结果 | |||
第一次 | 第二次 | 第三次 | ||
淋洗水细菌内毒素 | ＜0.25EU/ml | ＜0.25EU/ml | ＜0.25EU/ml | |
淋洗水微生物限度 | ＜1CFU/100ml | ＜1CFU/100ml | ＜1CFU/100ml | |
淋洗水TOC残留量 | 背景值 | 21 ppb | 31ppb | 36 ppb |
测量值 | 24 ppb | 38 ppb | 44 ppb | |
实测值 | 3 ppb | 7ppb | 8 ppb | |
结论 | 超滤系统在实际生产结束后放置2小时后再按规定的清洗程序进行清洗，清洗后各个样品检测结果若均满足上述各项可接受标准，则此超滤器生产结束至清洗的最长待清洗保留时间为1.5小时。 | |||
5 讨论
通过对三次验证所得数据分析得出：按照超滤系统的前、后清洗程序清洗超滤系统后的清洗效果均符合生产工艺要求。经验证，超滤超滤系统生产前清洗有效期为5h、超滤系统生产后清洗待清洗保留时间为1.5h。本超滤系统可投入生产使用。
参考文献
[1]《药品生产质量管理规范》 2010年修订，卫生部令第79号
[2]《药品生产质量管理规范》附录确认与验证
[3] 《中国药典》 2020版
[4] 《药品生产验证指南》 2003版
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