HPLC法测定小麦中维生素B2的含量

HPLC法测定小麦中维生素 B2的含量

杨雪，李硕

（黑龙江八一农垦大学 大庆 163319）

摘要：建立了HPLC法测定小麦中维生素B₂的含量。采用C₁₈色谱柱进行分离，以乙酸钠:甲醇=65:35为流动相，用高效液相色谱仪进行测定，结果表明：维生素B₂在0.01-0.20mg/L范围内呈现良好的线性关系，相关系数为0.9994，检出限为0.020mg/100g，加标回收率为91.3-94.1%，RSD为0.91-1.20%，该方法简单、高效、准确，可以满足测定需求。

关键词：小麦；维生素B₂；高效液相色谱仪

小麦是我国四大主粮之一，近年来，我国小麦种植面积不断增加，产量逐年增长，小麦是日常生活中不可缺少的，它可以为我们提供身体所需的碳水化合物、微量元素以及维生素等^[1]，其中含有的维生素B₂，又名核黄素，可以促进细胞再生，保护皮肤，无论大人还是小孩都需要日常补充，在人体生长代谢中有着至关重要的作用^[2],还可以降低身体各个部位发生炎症的概率^[3-4]。

目前，维生素B₂的主要检测方法有高效液相色谱法^[5],荧光分光光度法^[6],超高效液相色谱法-质谱联用法^[7],本文根据食品安全国家标准^[8]及相关文献，对小麦中的维生素B₂含量的测定方法进行了改进，利用高效液相色谱仪测定，该方法操作简单、价格低廉、结果准确。

1 实验部分

1. 1. 仪器与试剂

液相色谱仪（美国Waters公司e2695型，配有荧光检测器），高压灭菌锅（上海博讯医疗仪器股份有限公司，CJJ79-1），pH计（梅特勒-托利多仪器上海有限公司，PF20），电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂，HH•B11•500-S-Ⅱ），分析天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司，ML204），注射器，滤膜（铭诚生物科技有限公司）

维生素B₂标准品（天津阿尔塔科技有限公司），盐酸、氢氧化钠（科密欧试剂有限公司），乙酸钠（泉瑞试剂），高峰淀粉酶、木瓜蛋白酶（源叶生物），甲醇(德国Fisher试剂公司)，超纯水

1. 2. 色谱条件

色谱柱：C18（150mm×4.6mm）；流速：1.0 mL/min；柱温：30℃；检测波长：激发波长462nm，发射波长522nm；流动相：乙酸钠溶液-甲醇（65:35）；进样量：10μL

1. 3. 标准曲线的制备

1.3.1标准储备液

在100mL容量瓶中精准称取10mL浓度为100mg/L的维生素B₂标准溶液，加入超纯水定容至刻度，得到10mg/L维生素B₂标准储备液。

1.3.2标准工作液

在5个100mL容量瓶中分别加入0.1、0.5、1.0、1.5、2.0mL浓度为10mg/L维生素B₂标准储备液，并加超纯水定容至刻度，得到浓度为0.01、0.05、0.10、0.15、0.20mg/L维生素B₂标准工作液。

1.3.3绘制标准曲线

将1.3.2中的0.01、0.05、0.10、0.15、0.20mg/L维生素B₂标准工作液进行分析，以色谱峰面积对应质量浓度进行回归分析，绘制标准曲线。

1. 4. 样品的测定

取100g小麦，用组织捣碎机充分打匀均质，准确称取10.00g小麦试样于150mL锥形瓶中，加入60mL0.1mol/L盐酸溶液，涡旋混匀，盖好瓶塞，放入高压灭菌锅内，121℃下保持30min，待温度降到40℃以下后取出，冷却至室温。用1mol/LNaOH溶液调pH至5.5左右，加入3mL混合酶溶液，摇匀，置于36℃培养箱中16h。将酶解液转移至100mL容量瓶中，加超纯水定容，混匀，室温下10000r/min离心5min，上清液过0.45μm滤膜，待高效液相色谱仪分析

1. 5. 计算

维生素B₂含量的计算公式：

2 结果与讨论

2.1流动相的选择

实验中分别对比了不同配比的乙酸钠-甲醇和不同配比的乙酸钠-乙腈作为流动相，观察仪器的出峰情况，结果表面：乙酸钠：甲醇=65：35时，出峰效果较好，所以实验中流动相配比为乙酸钠：甲醇=65：35

2.2柱温的选择

若柱温较低会导致组分流出时间太长，甚至某组分滞留在色谱柱中，反之，柱温过高则会使出峰情况不稳定，峰型不对称。故实验中分别探讨了温度为25℃、30℃、35℃的出峰情况以及回收率，结果表明：柱温为30℃时，出峰效果最好，回收率最高。

2.3pH的选择

试样溶液的酸碱度可使目标物呈现不同的状态，影响目标物的稳定性，实验中对比了不同pH值的回收率，最终结果得出，pH在5.5左右，回收率达到最大值。

2.4标准曲线及检出限

在0.01-0.20mg/L的线性范围内，以维生素B2的浓度为横坐标，其峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得出色谱峰面积与浓度呈现良好的线性关系，线性方程为y =2593.1x + 12.707，相关系数为0.9994。如图1所示

图1. 维生素B₂的标准曲线

在最佳实验条件下，根据公式(1)计算仪器检出限

式中LOD为仪器的最低检出限；N为基线噪声；Q为近似于检出限被测物质量浓度；I为被测物质的信号响应值

LOD=0.020mg/100g

2.5回收率和精密度

按照1.4方法实验，取已知浓度小麦进行加标回收实验，测得加标回收率，以此来验证实验方法的准确度，加标浓度分别为 0.05mg/L、0.1mg/L、0.15 mg/L；

按照实验方法，重复做6次实验，测定相对标准偏差（RSD），测定结果如表1所示

表1. 测定结果的加标回收率及相对标准偏差（n=6）

2.6实际样品分析

在最佳条件下，将市购3种小麦进行高效液相色谱仪-荧光检测器进行分析，测定结果如表2所示

表2. 样品测定结果

3 结论

本文建立了HPLC法测定小麦中维生素B₂的含量，维生素B₂在0.01-0.20mg/L范围内呈现良好的线性关系，相关系数为0.9994，检出限为0.020mg/100g，加标回收率为91.3-94.1%，RSD为0.91-1.20%，结果表明该方法可以满足小麦中维生素B₂的检测要求。

参考文献

1. 王敏娟,尹丹阳,胡佳薇,田丽,袁文婷,乔海鸥.陕西产小麦不同加工程度的营养成分分析及评价[J].卫生研究,2021,50(01):69-74+85.

2. 刘艳红,努娜,马晓光.荧光法测定蘑菇中维生素B2的含量[J].赤峰学院学报(自然科学版),2017,33(22):7-8.

3. 徐群,黄华山,王英楠,李洪涛,赵旭.维生素在畜禽生产中应用的研究进展[J].山东畜牧兽医,2020,41(09):88-91.

4. 景维华.家禽维生素B2的应用分析[J].畜牧兽医科技信息,2021(02):181.

5. 陈明宏,王思琦,李泽坤.高效液相色谱测定五维赖氨酸颗粒中5种成分的含量[J].临床医学研究与实践,2021,6(23):11-13+26.

6. 潘雅南,梁梓超,周启高,钟桂冬,罗惠玲,张泽蓉,朱瑞琦,王健龙,陈仲运,李艳萍.荧光法测定维生素B2片剂含量及其均匀度的研究[J].广州化工,2019,47(17):125-127+156.

7. 任强强,赵优琴,许文,黄鸣清,叶水国,石贞香.UHILIC-MS/MS法同时测定复方三维右旋泛酸钙糖浆中5种维生素的含量[J].药学实践杂志,2018,36(06):512-517+528.

8. GB 5009.85-2016 食品安全国家标准 食品中维生素B2的测定

基金项目：大庆市指导性科技计划项目（zd-2020-70），黑龙江八一农垦大学（校内培育课题资助计划，ZRCPY202124）

作者简介：杨雪（1996-），女，研究实习员，硕士，现主要从事分析化学方向.

邮寄地址：黑龙江省大庆市高新区国家杂粮工程技术研究中心杨雪，18745776499.