荧光PCR探针熔解曲线法检测老年肺结核患者耐药性的临床效果

荧光PCR探针熔解曲线法检测老年肺结核患者耐药性的临床效果

张微

吉林市中心医院 132000

【摘要】目的探讨荧光聚合酶链反应（PCR）探针溶解曲线法在老年肺结核患者耐药性检测中的价值。方法  收集老年肺结核患者痰标本55份，经菌种鉴定分离133株（例）菌株作为研究对象。对其采用PCR探针溶解曲线法、表型药敏试验，分析对利福平、异烟肼、喹诺酮、卡那霉素的耐药性。对比PCR探针溶解曲线法、表型药敏试验两种检测方法耐药性检测结果的一致性，采用kappa值评价。结果 PCR探针溶解曲线法、表型药敏试验结果显示在利福平、异烟肼、喹诺酮、卡那霉素中一致性均较好，kappa值分别为0.76、0.81、0.84、0.80。结论  PCR探针溶解曲线法在肺结核患者耐药性的检测中具有较高价值，基本与表型药敏试验结果相当。

【关键词】荧光聚合酶链反应；探针溶解曲线法；表型药敏试验；肺结核；耐药性

    结核病是常见传染性疾病，我国近年来防控取得较好效果，结核病的发病率已显著下降。但目前依然有较高存量的患者结核病患者，此类患者需要长期服用抗结核病药物，如利福平、异烟肼、喹诺酮等。但长期服用抗结核病药物可能导致耐药性问题，故为了保障治疗疗效，需要进行耐药性检测以选择合适药物进行治疗。表型药敏试验是结核病耐药性检测的主要方法，优势是检测结果可靠性高，缺点是耗时长、操作繁琐。随着分子生物学的发展，出现了PCR探针溶解曲线法的检测方案，该检测方法具备检测操作简单、迅速等优点，但其可靠性还需进一步的验证。本次研究将PCR探针溶解曲线法与表型药敏试验在肺结核耐药性中的检测结果进行对比，分析前者的应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

    选取本院2021年3月至2022年2月收治的55例老年肺结核患者为研究对象，采集55份痰液标本。入组研究的患者男性33例，女性22例；年龄60~77岁，平均（68.52±5.96）岁；用药时间3~6个月，平均（4.64±1.20）个月。

    纳入标准：（1）经临床检查证实为肺结核，年龄≥60岁的患者；（2）自愿参与研究，签署知情书。

    排除标准：（1）资料不全者；（2）未采用PCR探针溶解曲线法或表型药敏试验者。

1.2 方法

1.2.1 结核分歧杆菌培养

    在证实为阳性痰液标本中加入2~3倍的4% N-乙酰半胱氨酸-氢氧化钠，液化15min。液化后进行分离培养，按照结核分歧杆菌的要求培养。培养完成后进行结核分歧杆菌菌种的鉴定。

1.2.2 PCR探针溶解曲线法

    检测时首先配制PCR反应液，吸取n×19.6μL PCR Mix和n×0.4μL TB酶混合液，加入到离心管内，混匀；再向每支PCR反应管内分装20μL，加入5μL相应提取样品或阳性、阴性对照，PCR扩增仪上进行扩增和溶解分析。使用的耐药突变检测试剂盒均为厦门致善生物科技股份有限公司产品，检测操作完全按照试剂说明书进行。

1.2.3 表型药敏试验

    检测按照《结核病诊断实验室检验规程》对利福平、异烟肼、喹诺酮、卡那霉素实施药敏试验。

1.3 观察指标

    （1）对比PCR探针溶解曲线法、表型药敏试验利福平、异烟肼、喹诺酮、卡那霉素在结核分歧杆菌中的耐药性。

1.4 统计学方法

    SPSS22.0完成统计分析，计数资料以频数、百分比（%）表示，一致性评价采用Kappa检验完成，其中Kappa＜0.4为一致性差，Kappa=0.4~0.75为一致性较好，Kappa＞0.75为一致性好。

2 结果

2.1 两种检测方法在结核分歧杆菌耐药性检测中的结果

    55份标本分离结核分歧杆菌菌株133株，结果显示：

    PCR探针溶解曲线法：利福平耐药株29株，敏感株104株；异烟肼耐药株35株，敏感株98株；喹诺酮耐药株19株，敏感株114株；卡那霉素耐药株10株，敏感株123株。

    表型药敏试验：利福平耐药株27株，敏感株106株；异烟肼耐药株36株，敏感株97株；喹诺酮耐药株18株，敏感株115株；卡那霉素耐药株8株，敏感株125株。

    一致性评价：在利福平、异烟肼、喹诺酮、卡那霉素中一致性均较好，kappa值分别为0.76、0.81、0.84、0.80。

3 讨论

    结核病的治疗往往需要6个月以上，而在长期服用药物的过程中可能产生耐药性，如未及时发现耐药性问题会导致治疗疗效受到影响。故在患者治疗期间，需要定期进行分歧杆菌耐药性的检测，以便于医师及时调整用药。传统检测方式表型药敏试验在结核分歧杆菌耐药性的检测中有成熟的应用，但是该检测方式具有操作繁琐、速度慢的缺点，故临床迫切需要一种检测准确率高，效率高的检测方式。

    随着分子检测技术的发展与完善，PCR探针溶解曲线法在结核分歧杆菌耐药性检测中有了更为广泛地应用。PCR探针溶解曲线法具有聚合酶链反应、荧光探针熔解曲线分析的优点，检测中对目的基因进行扩增，记录溶解温度与对照的差值，继而评估是否有耐药基因的突变。PCR探针溶解曲线法检测效果高，操作简单，在替代表型药敏试验中具有一定前景。

    本次研究对PCR探针溶解曲线法、表型药敏试验两种检测方法的耐药性检测结果进行对比，最终证实在利福平、异烟肼、喹诺酮、卡那霉素中一致性均较好，kappa值分别为0.76、0.81、0.84、0.80，kappa值均＞0.75。提示耐药性检测结果一致性好，也间接证明PCR探针溶解曲线法具有与表型药敏试验相当的检测价值。

    综上所述，PCR探针溶解曲线法在结核杆菌耐药性的检测中具有较高价值，值得推广应用。

参考文献

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