固定酶底物法应用于污泥粪大肠菌群的检测

固定酶底物法应用于污泥粪大肠菌群的检测

李洪

东莞市东江检测有限公司

摘要：目前污泥中粪大肠菌群的检测方法有多管发酵法和滤膜法，这两种方法均是根据总大肠菌群具有的生物特性，经过初发酵、平板分离、革兰氏染色镜检、复发酵的过程检测污泥中粪大肠菌群的数量。传统方法检测前须准备大量培养基，检测耗时长，有诸多缺点。现希望通过将固定酶底物法应用于污泥中粪大肠菌群的检测，缩短检测时间，节省人力成本，提高检测效率和检测的准确率。

关键词：污泥粪大肠菌群  滤膜法  固定酶底物法

随着科学技术的发展，城镇化进程的加快，城镇生活污水总量逐年提高，从而导致产生的大量的污泥[1]。粪大肠菌群是城镇污水处理厂污泥泥质控制的一项重要指标[2]。粪大肠菌群是作为粪便污染指标菌提出来的，主要是以该菌群的检出情况来表示样品中有否有粪便污染。粪大肠菌群数量的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。在CJ/T221-2005《城市污水处理厂污泥检验方法》中城市污泥粪大肠菌群的检验采用滤膜法测得[3]。该方法使用新滤膜前需对滤膜进行鉴定，同时对滤膜上形成的不典型或疑难的菌落须进行涂片、革兰氏染色和镜检，另一部分接种于EC培养基看是否产气。由此可见，滤膜法检测污泥粪大肠菌群非常繁琐，需要较长的时间获得准确的检测结果。随着酶底物技术的发展，固定底物酶底物法越来越多地应用于检测水中总大肠菌群、大肠埃希氏菌、耐热（粪）大肠菌群，是GB/T5750.12-2006的国标方法[4]。污泥粪大肠菌群的检测同样是通过无菌水逐级稀释检测。因此，希望通过运用固定底物酶底物法检测污泥粪大肠菌群，以便更快捷的方式获得准确的检测结果。

1 材料与方法

1.1材料

培养基：M-TEC培养基、EC培养基、酶底物试剂（含97孔定量盘）

仪器：恒温培养箱、高压蒸汽灭菌器、显微镜、程控定量封口机、干热灭菌箱、振荡器、滤膜过滤装置

其他：75mm平皿、接种环、革兰氏染色试剂盒、移液枪、试管、无菌瓶、无菌水、滤膜（孔径为0.45μm）、1L烧杯、火焰枪

1.2样品采集和制备

1.2.1取样方法

采用多点取样混合，样品质量不小于1kg。

1.2.2样品制备

用消毒过的小刀或者不锈钢药勺从样品中多点取样，研磨粉碎后，称取约1g样品，精确至0.0001g，备用。

1.3实验方法

1.3.1 CJ/T221-2005《城市污水处理厂污泥检验方法》中滤膜法

1.3.1.1滤膜灭菌

将滤膜放入烧杯中，加入蒸馏水，煮沸灭菌3次，每次15min。前两次煮沸后换水洗涤2次以去除膜内残留溶剂。

1.3.1.2过滤

将样品倒入灭菌试管中，按1：10的倍数稀释，然后进行抽滤。用无菌镊子夹取滤膜放置于不锈钢滤头上，于滤杯内先加入约10ml无菌水，然后取1ml稀释好的待测样品，混合后抽滤。抽滤后再用少量无菌水冲洗滤杯内壁。抽完水样后继续抽气约5-10s，停止抽气，取下滤杯。用无菌镊子夹取滤膜边缘，置于M-TEC培养基上，滤膜截留菌面朝上，滤膜与培养基之间应无气泡，将平皿倒置，置于44.5℃恒温箱内培养24h。

1.3.1.3观察结果及验证

在M-TEC培养基上，粪大肠菌群菌落呈黄色。计数此类菌落数目。根据过滤水样量及滤膜上菌落数，乘上稀释倍数，即为每克污泥中粪大肠菌群数。对于不典型或难以辨认的菌落，应取一部分进行革兰氏染色镜检。另一部分接种于EC培养基中，经44.5℃培养24h后观察是否产气。产气则为有粪大肠菌群。

1.3.2 固定酶底物法

1.3.2.1  制样铺板

将样品倒入灭菌试管中，按1：10的倍数稀释。取1ml样品加入预装灭菌的100ml无菌瓶内，加入一支酶底物试剂，摇匀溶解后，倒入97孔板中，用定量封口机封口。将封好口的97孔板放置于44.5℃，培养24h。

1.3.2.2观察结果

观察97孔板中颜色的变化，颜色比97孔阳性比色盘相同或者颜色更深则为阳性，反之则为阴性。计算大孔和小孔的阳性孔数，查对应的MPN表得到查表数，乘回相应的稀释倍数得到定量的检测结果。如果结果不容易判断，可以继续培养4h。

1.4 微生物检测结果为偏态分布，按统计分析要求，其检测结果应以10为底的对数转换后进行分析。

2  实验结果与分析

2.1精密度实验

某污水厂污泥样品分别用滤膜法和固定酶底物法进行6次重复测定，结果见表1。

表1  精密度实验结果

注：标准偏差（S）和相对标准偏差（RDS%）为原始数据以10为底数的对数转换后所得。

由上表可见，固定酶底物法测得结果的精密度要优于滤膜法。固定酶底物法结果是由查表得出，是以最大可能数来表示的，它是基于泊松分布的一种间接计数方法。表中相同样品，用不同方法得出结果差异较大，是因为酶底物法灵敏度更高，处于休眠状态或者活性低的细菌同样能够被培养。同时，固定酶底物法测得结果不需要再验证，该方法操作简便，准确度高，无环境要求限制，只需要相对干净的环境即可开展实验，无需在洁净室内操作。

2.2结果一致性实验

2.2.1选取同一个污泥样品用两种方法分别检测30次后统计分析，比对两种方法测得的粪大肠菌群结果（见表2）。

表2  实际样品滤膜法和酶底物法比对结果

如表2所示，滤膜法和酶底物法30次检验结果统计，统计量F为1.34，小于1.86；t检验法t为1.980，小于2.002。因此，两种方法不存在显著性差异。

2.2.2质控样分析

分别用滤膜法和固定酶底物法对有证标准物质进行检测，同时做平行检测，检测结果见表3。

表3   有证标准物质检测结果

如上表所示，滤膜法和固定酶底物法检测有证标准物质的结果不完全一致，但均在可接受范围内，说明两种方法均有一定的准确性。

3结论

经过实验表明，滤膜法和酶底物法检测污泥中粪大肠菌群不存在显著性差异，酶底物法精密度优于滤膜法，有更好的重现性。而且实验方法简便，不需要平板分离和染色镜检的过程，缩短了实验的时间，简便易于操作。因此，可以用固定酶底物法替代滤膜法检测污泥中粪大肠菌群。

参考文献

[1]卢彦丞.城镇污水厂污泥处置现状及可持续发展对策[J].资源节约与环保,2021,1.

[2]应立春.污泥中粪大肠菌群菌值检测方法的改进[J].广州化工,2014,42（6）.

[3]中华人民共和国建设部.CJ/T221-2005,城市污水处理厂污泥检验方法[S].1版,北京:中国标准出版社,2006.

[4]中华人民共和国卫生部.GB/T5750.12-2006,生活饮用水标准检验方法微生物指标[S].1版,北京:中国标准出版社,2007.