十六酸拉米夫定酯乳脂体包封率测定方法研究

 十六酸拉米夫定酯乳脂体包封率测定方法研究

刘畅，隋小宇，王静，韩翠艳，马晓星，朱文全，钱佳怡

齐齐哈尔医学院药学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006

摘要：目的：建立十六酸拉米夫定酯（LAP）乳脂体包封率的测定方法。方法：建立HPLC 法测定乳脂体中LAP含量。ODS-C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）；以甲醇-水(体积比95∶5)为流动相；流速：1.0mL·min-1；进样量：20μL；检测波长：272nm。分别采用葡聚糖凝胶过滤法、滤膜过滤法测定LAP乳脂体的包封率，建立乳脂体测定包封率的方法。结果：LAP在1-25μg/mL-1内线性关系良好，标准曲线方程为y=0.2734x-0.1505，r=0.9999，精密度、回收率良好。葡聚糖凝胶过滤法及滤膜过滤法均能将游离药物与乳脂体有效分离。葡聚糖凝胶柱回收率在97.9%-99.6%，RSD<0.5%，测得样品包封率平均值为91.4%，RSD为2.0%，但操作繁琐，耗时长。滤膜过滤法可截留99.9%以上的游离药物，截留能力良好，测得样品包封率平均值为92.3%，RSD为1.3%，所测得的包封率数据稳定、差异小，且操作简单，耗时短。结论：滤膜过滤法操作简单，结果稳定可靠，可作为LAP乳脂体包封率的测定方法。

关键词: 乳脂体; 十六酸拉米夫定酯; 包封率

拉米夫定(LA)是用于抗慢性乙型肝炎（乙肝）病毒常用治疗药物[1]，还可用于乙型肝炎肝硬化失代偿期患者，可改善肝功能，延长生存期[2]。LA虽具有较好疗效但有一定的不良反应[3]，主要因为在体内容易扩散降解，并形成相对平均的组织分布，未能在肝脏病灶形成有效抗病毒的作用浓度等原因导致[4]。乳脂体属于一种介于脂质体与O/W 乳剂之间的新型胶体载药系统，其脂质内核的结构尤其适合亲脂性药物的包封。十六酸拉米夫定酯（LAP）是LA 的前体药物[4]，脂溶性较高，制成乳脂体可提高药物包封率的同时，通过改善体内分布特征有望降低不良反应。

包封率是乳脂体制备及质量评价的关键指标之一。常用的包封率测定方法包括透析法、超滤离心法、超速离心法、凝胶柱层析法[5]、滤膜过滤法等[6]。根据LAP的溶解性及其乳脂体的特点本研究选择滤膜过滤法及葡聚糖凝胶过滤法测定LAP乳脂体的包封率。通过建立HPLC分析方法测定乳脂体中LAP含量，并通过对比筛选包封率的测定方法，为制剂制备及质量评价提供基础。

1 仪器与试药

1.1仪器

LC-1000型高效液相色谱仪（山东鲁南瑞虹化工仪器有限公司），旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司），超声波细胞破碎仪（上海沪析实业有限公司），针头滤器(0.22μm，0.45μm)（碧云天生物技术公司），马尔文Nano ZS90Zetasizer纳米粒度仪（西安明克斯检测设备有限公司），

1.2试药

LAP（实验室自制）；注射用大豆磷脂（上海太伟药业有限公司）；胆固醇、三硬脂酸甘油酯、吐温-80（上海麦克林生化有限公司）；甲醇为色谱纯，其余试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1LAP乳脂体及空白乳脂体的制备

采用薄膜分散法制备LAP乳脂体。处方量的LAP，胆固醇，磷脂，三硬脂酸甘油酯和吐温-80，加入适量氯仿使其充分溶解。使用旋转蒸发仪减压蒸发有机溶剂，形成均匀的薄膜。加入PBS（pH6.8）水化，超声破碎，获得LAP乳脂体。在不加入LAP的条件下，同法操作制备空白乳脂体。取LAP乳脂体稀释液适量，用马尔文Nano  ZS90Zetasizer 纳米粒度仪测定其粒径与粒径分布，平均粒径为115.5nm，分散系数为0.152。

2.2 含量测定方法的建立

2.2.1色谱条件[4]

色谱柱：ODS-C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：甲醇-水(体积比95∶5)；流速：1.0mL·min-1；进样量：20μL；检测波长：272nm。

2.2.2破乳剂种类考察

取“2.1”项下LAP乳脂体5mL，置于10mL量瓶中，加PBS稀释定容至刻度得LAP乳脂体稀释液。各取该稀释液1mL，置于10mL量瓶，分别加甲醇、无水乙醇、氯仿稀释定容至刻度，观察破乳现象。其中甲醇破乳后溶液澄清破乳完全，选择甲醇作为破乳剂。

2.2.3溶液的制备

LAP对照品溶液：精密称取LAP对照品适量，甲醇溶解，稀释成质量浓度为100μg·mL-1的的溶液。

LAP乳脂体及空白脂质体供试品溶液：取“2.2.2”项下乳脂体稀释液1mL，置于10mL量瓶，加甲醇定容至刻度，得LAP乳脂体供试品溶液；同法制备空白脂质体供试品溶液。

2.2.4 专属性

“2.2.3”项下溶液各20μL，按“2.2.1”色谱条件进样，结果LAP保留时间约为9.5min，乳脂体辅料对测定无干扰，色谱图见图1。

A                                  B

                    C

A.空白乳脂体溶液   B.LAP对照品溶液   C.LAP乳脂体溶液

图1  HPLC色谱图

2.2.5 标准曲线的绘制

精密吸取系列体积LAP对照品溶液，甲醇稀释配制浓度为1.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0μg·mL-1的LAP标准溶液。按“2.2.1”色谱条件进样分析，以峰面积对浓度进行线性回归。结果LAP在1-25μg/mL-1内线性关系良好，标准曲线方程为y=0.2734x-0.1505，r=0.9999。

2.2.6 精密度试验

取浓度为1.0、10.0、25.0μg·mL-1的LAP标准溶液，按“2.2.1”色谱条件进样分析。每个样品进样6次，连续测定5天，得日内、日间精密度。结果高、中、低浓度的LAP标准溶液日内精密度RSD分别为2.7%、1.9%、0.7%，日间精密度RSD分别为2.7%、2.6%、1.4%，精密度良好。

2.2.7 回收率试验

取空白乳脂体稀释液1mL，分别加入LAP对照品溶液，甲醇稀释，配制浓度为1.0、10.0、25.0μg·mL-1的含空白乳脂体的LAP溶液。按“2.2.1”色谱条件进样分析，计算浓度及平均回收率。结果高、中、低浓度回收率分别为 99.0％、 98.7％ 、99.7%，RSD 分 别 为 0.73% 、0.59% 、1.2%（n＝3），符合方法学要求。

2.3 LAP乳脂体包封率测定方法的考察

2.3.1 葡聚糖凝胶过滤法

2.3.1.1 葡聚糖凝胶柱的预处理

取Sephadex G-50葡聚糖凝胶精密称取2.0g，置于烧杯中，加适量的纯化水，煮沸5h，超声10min得葡聚糖凝胶悬浮液。将该悬浮液缓慢、连续、均匀装柱，使其均匀沉积，得约14cm高的葡聚糖凝胶柱。缓慢滴加PBS，水化平衡4个柱体积，加PBS封柱备用。

2.3.1.2 洗脱曲线的绘制

打开层析柱低端出口，使柱内的PBS流至没过葡聚糖凝胶的顶端时，关闭出口，取LAP乳脂体1mL缓慢滴于柱内，打开底端出口使LAP乳脂体渗入葡聚糖凝胶内部，完全渗入后关闭出口，缓慢滴加PBS。收集洗脱液，每1mL收集一次，收集50管。每管中加入1mL甲醇，过滤后按“2.2.1”色谱条件进样分析，绘制药物浓度与洗脱体积的洗脱曲线，见图2。结果3-15mL为LAP乳脂体部分，27mL~33mL为游离药物。葡聚糖凝胶过滤法能使LAP乳脂体与游离药物分离。

图2  洗脱曲线图

2.3.1.3柱回收率

根据参考文献[7]，取LAP对照品适量，加入“2.1”项下LAP乳脂体中，配制包封率约为80%与50%的样品。分别量取三种包封率不同的LAP乳脂体样品各1mL，分别滴加到凝胶柱上，“2.3.1.2”项下方法洗脱,收集洗脱液。按“2.2.1”色谱条件进样分析，计算柱回收率。结果三种样品柱回收率在97.9%-99.6%，RSD<0.5%，柱回收率良好，满足乳脂体包封率测定要求。

2.3.1.4 葡聚糖凝胶过滤法测定包封率

取三批LAP乳脂体各1mL，分别缓慢滴加于葡聚糖凝胶柱内，按“2.3.1.2”项下方法洗脱，将乳脂体全部接于25mL量瓶中，加甲醇稀释破乳。按“2.2.1”色谱条件进样分析，平行测定三次。计算乳脂体中LAP含量C。

取未过柱的LAP乳脂体1mL，置于25mL量瓶中加14mLPBS稀释，加甲醇稀释定容至刻度。按“2.2.1”色谱条件进样分析，平行测定3次。计算乳脂体中LAP的含量C总，按下式计算包封率。

结果三批样品包封率的平均值为91.4%，RSD为2.0%。

2.3.2 滤膜过滤法

2.3.2.1 滤膜过滤法分离作用试验

精密称取LAP 50、100mg，分别加入5mL空白乳脂体稀释液混匀，得含有LAP的空白乳脂体混悬液。经0.45μm的微孔滤膜过滤，过滤后的溶液用甲醇稀释2倍，在“2.2.1”项下的色谱条件下进样测定，平行测定三次，得过膜后的LAP浓度C后。取过滤前的液体0.1mL，用甲醇稀释至100mL在“2.2.1”项下的色谱条件下进样测定，平行测定三次，得过膜前的LAP浓度C前。

按公式：1-(C后/C前)×100%，计算膜的分离作用。结果两种质量的LAP，1-(C后/C前)×100%平均值分别为99.95%、99.96%，即有99.95%、99.96%的游离药物被截留，截留能力良好，可以使用滤膜过滤法将游离LAP与乳脂体分离。

2.3.2.2 滤膜过滤法测定包封率

取三批LAP乳脂体各5mL，置于10mL量瓶中，加PBS(pH6.8)稀释定容至刻度，得LAP乳脂体稀释液，按滤膜过滤法分离游离药物与乳脂体。过滤前及过滤后的液体分别甲醇稀释10倍，按“2.2.1”项下的色谱条件进样测定，平行测定三次，计算乳脂体中包封的LAP的量C及乳脂体中所含LAP的总量C总。按下式计算包封率。

，结果三批次样品平均包封率为92.3%，RSD为1.3%。

3 讨论

在包封率方法的考察中，除考察了葡聚糖凝胶柱层析法和滤膜过滤法外，还考察了低温超速离心法和超滤离心法。其中超速离心法在4℃、14000r/min离心1小时，但离心后的乳脂体仍有乳光，说明其分离不完全。在筛选超滤离心法时，由于LAP在PBS中的溶解度极低，未包封药物以微晶形式存在于体系中，导致用该法无法分离药物与乳脂体。而文献中有选择向体系中加入少量甲醇的方式，达到使脂溶性药物溶解的目的，从而实现药物与载药微粒的分离。但考虑甲醇对乳脂体的破乳作用，最终未选择该方法。

滤膜过滤法和葡聚糖凝胶均能够很好的分离LAP乳脂体和游离药物，且两种方法所测得LAP乳脂体包封率结果基本一致。但葡聚糖凝胶柱层析法操作繁琐，耗时长。而滤膜过滤法测定RSD值更小，且操作简单、耗时少，滤膜过滤法更适合作为LAP乳脂体包封率的测定方法。

参考文献：

[1] 张杨, 仁君, 殷诺雅, 等.基于美国FAERS数据库的拉米夫定妊娠相关不良反应信号挖掘研究[J]. 中国药物应用与监测, 2022, 19(03): 182-185+208.

[2] 林庆, 全天问, 曾义岚. 拉米夫定联合阿德福韦酯治疗乙型肝炎肝硬化失代偿期的效果及对红细胞分布宽度和炎性因子水平的影响[J].解放军医药杂志, 2021, 33(09), 92-96.

[3] Dienstag JL, Schiff ER, Mitchell M , et al .Extended Lamivudine retreatment for chronic hepatitis B[ J] .Hepatology, 1996, 24(1):188.

[4] 薛克昌. 肝靶向十六酸拉米夫定酯固体脂质纳米粒的实验研究[D].西安: 第四军医大学.2002: 11.

[5] 张艺, 杭太俊, 宋敏. 载药脂质体包封率测定方法的研究进展[J]. 中国药科大学学报，2021, 52（2）: 245 – 252.

[6]顾薇, 陈军, 乔广军, 等. 9-硝基喜树碱复合磷脂隐形脂质体的制备工艺研究[J]. 南京中医药大学学报, 2014, 30(2): 168-172.

[7] 张晓蕾, 乔红群, 刘晶. 复方盐酸伊立替康和氟尿嘧啶脂质体注射液包封率测定方法研究[J]. 中国现代应用药学, 2021, 38(13): 1588-1593.

基金项目：黑龙江省教育厅省属本科高校基本科研（2018-KYYWF-0096）

作者简介：刘畅，女，1982.02，汉族，齐齐哈尔人，硕士，讲师，研究方向：新剂型及新技术研究，