抗药性基因β-内酰胺素的进化分析

抗药性基因β-内酰胺素的进化分析

单麒文2王秀1

江苏理工学院 化学与环境工程学院 ，江苏 常州 213001；2.江苏理工学院 国际教育学院，江苏 常州 213001

摘要：β-内酰胺酶作为抗药性基因不但参与生态系统中微生物间的协调合作调控，而且在疾病的抗药性机制中起关键性作用。本研究主要是对大肠杆菌的TEM β-内酰胺酶的序列进行系统的生物信息学分析，分析结果显示TEM-1 β-内酰胺酶是一个不稳定的疏水性的蛋白，同时根据TEM-1 β-内酰胺酶的序列获得11条跨物种不同类型的β-内酰胺酶（TEM类型、SHV类型、KPC类型、AmpC类型）。对这些β-内酰胺酶序列进行注解并构建进化树，通过分析发现大部分β-内酰胺酶的相对保守，序列的相似度较高，在进化压力下有可能在物种间保存着相同的抗药性机制。这些大多数β-内酰胺酶序列出现了单个位点氨基酸的差别现象，猜测在长期的进化压力下由于基因突变导致的单个氨基酸的不同。β-内酰胺酶进化分析结果将为发现新的微生物中的β-内酰胺酶提供重要的信息来源，将为微生物中阻断抗药性机制进行的疾病防治和预防起关键性作用。

关键词：TEM-1β-内酰胺酶；大肠杆菌；生物信息学；进化分析

整个环境生态系统的离不开抗药性基因的出现，抗药性基因存在土壤的大量微生物、植物、昆虫、哺乳动物及人类中。土壤微生物群落作为抗药性基因的起源能够提供抗药性基因在微生物细菌和病原体中相互交换，抗药性基因的发展已经造成很多公共危害，甚至造成物动的疾病和人类疾病（1）。

近年来抗药性基因的研究主要集中在β-内酰胺素（beta-lactam resistance gene）的临床研究，第一个β-内酰胺素（TEM）是在大肠杆菌中发现，最早的β-内酰胺素是不能运用于青霉素酶（2）。β-内酰胺酶可在多种微生物中产生，例如革兰氏阳性细菌，阴性细菌，抗氧化剂细菌，厌氧细菌，放线菌和酵母等等 (3)。随后发现了超过800多种的β-内酰胺素。最常见主要有TEM型酶和SHV型酶（4）。最近的研究报道较多的是肠道细菌中的β-内酰胺素的抗药性分子机制和临床的重要性。猪链球菌的β-内酰胺素在大数据分析猪链球菌的抗药性基因中被发现（5）。同时目前在肺炎链球菌数据分析中也发现了抗药性基因β-内酰胺素。不断增加的β-内酰胺素的种类是由于生态系统中大部分的微生物不断适应环境受到进化压力产生快速的基因复制和重组的β-内酰胺素的变体（6）。

β-内酰胺酶又称为盘尼西林酶 、头孢菌素酶 ，是一类由某些细菌生成来提供多重抗药性， 对抗β-内酰胺类抗生素的酶 。β-内酰胺酶的抗药性功能机制有多种，最典型的机制是水解四元β-内酰胺环酰胺键的β-内酰胺酶使药物无效以及细菌不受攻击（7）。根据β-内酰胺酶氨基酸序列同源性分类，可将β-内酰胺酶主要分为四类，A类丝氨酸内酰胺酶、B类金属内酰胺酶、C类丝氨酸头孢菌素酶、D类丝氨酸氧化酶。其中A类、C类和D类酶主要是使用具有催化活性的丝氨酸攻击不同的内酰胺抗生素的内酰胺键（8）。

随着生物信息学的不断发展，序列比对和蛋白质分析成为生物学研究领域的重要的分析手段之一， 物种的基因组序列数据在生物信息学不断发展的状态下迅速增加，物种序列迅速的更新也成为可能（9）。大量新物种序列的分析有待于更新和分析，对跨物种的多序列进化分析尤为重要。同时跨物种中抗性基因不但能够在生态系统中协同起调节作用，而且跨物种抗性基因的抗药性对人类疾病的防治具有重要作用（10）。在这样新形势下和条件下，对于生态系统中物种的β-内酰胺素的生物信息学分析以及跨物种β-内酰胺素进化分析将对病原微生物的传播和疾病的防治以及土壤生态系统的调节起重要的作用。本研究将大肠杆菌中的β-内酰胺酶的基本序列信息进行系统分析，同时选择其它物种不同类型β-内酰胺酶进行进化分析，这些数据更新后的分析结果将为抗性基因在生态系统中协同起调节和抗性基因的抗药性对人类疾病的防治提供更有价值理论基础。

1材料和方法

1.1β-内酰胺素基因生物信息学分析的内容

1.1.1大肠杆菌中TEM-1β-内酰胺酶基因全长序列分析

首先登陆NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/和运用blast工具对大肠杆菌中TEM-1β-内酰胺酶基因核酸序列特征进行分析。其次使用ExPAsy程序https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam对大肠杆菌中TEM-1β-内酰胺酶基因蛋白序列进行注解。

1.2其它物种中β-内酰胺酶基因的进化分析

在大肠杆菌中TEM-1β-内酰胺酶基因生物信息学分析的前提下增加了其它物种和其它类型β-内酰胺酶基因进化分析。 这些物种的β-内酰胺酶基因包括：TEM-1（E. coli）、TEM-30 （Proteobacteria）、AmpC （K.

pneumoniae）、AmpC （E. coli）、SHV-1（K. pneumoniae）、SHV-2 （E. coli）、SHV-2（K. pneumoniae）、KPC-1 （K. pneumoniae）、KPC-2（K. pneumoniae）、KPC-2（K. pneumoniae）。

2 结果和分析

2.1 大肠杆菌TEM-1β-内酰胺酶基因核酸序列和蛋白序列的分析

在ncbi网站https://www.ncbi.nlm.nih.gov/获得大肠杆菌TEM-1β-内酰胺酶基因的核酸序列，通过分析获得大肠杆菌TEM-1β-内酰胺酶基因核酸序列全长为861bp，位置在大肠杆菌基因组AY458016.1的24050-24910。分析获得大肠杆菌TEM-1β-内酰胺酶氨基酸序列编码286个氨基酸，序列号为AAR25033.1

使用ExPAsy程序分析大肠杆菌TEM-1β-内酰胺酶蛋白的一级结构，蛋白质的疏水性预测疏水性最大值达到2.5以上，该蛋白显示了较强的疏水性（如图1）。

           图1 大肠杆菌TEM-1β内酰胺酶全长cDNA的序列分析图

2.2 其它物种中β-内酰胺酶基因同源基因的分析

我们选取了β-内酰胺酶的四种类型进行分析，这四种类型分别是TEM类型（TEM-1 E. coli、TEM family class A S. enteric、TEM30 E. coli）、SHV类型（SHV-1 E. coli 、SHV-1 K. pneumoniae、SHV2 E. coli、SHV2 K. pneumoniae）、KPC类型（KPC-1 K. pneumoniae、KPC-2 K. pneumoniae）、AmpC类型（AmpC E. coli、AmpC K. pneumonia）。

首先TEM类型β-内酰胺酶（TEM-1 E. coli、TEM family class A S. enteric、TEM30 E. coli）分析结果显示：TEM-1 E. coli 和TEM family class A S. enteric只有一个氨基酸不同，在序列的199位置。TEM family class A S. enteric和TEM30 E. coli只有一个氨基酸不同，在序列的241位置。在TEM类型β-内酰胺酶氨基酸序列的相似度非常高。SHV类型（SHV-1 E. coli 、SHV-1 K. pneumoniae、SHV2 E. coli、SHV2 K. pneumoniae）分析结果显示：SHV-1 K. pneumoniae、SHV2 E. coli、SHV2 K. pneumoniae只有两个位点的氨基酸不同，分别在序列的31和234的位置，SHVβ-内酰胺酶氨基酸序列的相似度非常高。KPC类型（KPC-1 K. pneumoniae、KPC-2 K. pneumoniae）分析结果显示：KPC-1 K. pneumoniae、KPC-2 K. pneumoniae 只有一个位置的氨基酸不同，在序列的174的位置。AmpC类型（AmpC E. coli、AmpC K. pneumonia）分析结果显示：AmpC E. coli（QNS35458.1）和AmpC K. pneumonia（ABL67017.1）同源性较高能达到70%的相似度。最后TEM-1 E. coli和SHV-1 K. pneumoniae比对分析发现同源性较高能达到65%的相似度。最后将跨物种的四种类型的β-内酰胺酶构建了进化树进行进化分析，分析结果显示四种类型的β-内酰胺酶根据不同类型成簇，这些簇分别是TEM-1簇、TEM-30簇、SHV簇、KPC簇、AmpC簇，这些簇与之前的比对结果一致。其中靠TEM-1簇最近的是TEM-30簇，说明TEM-1簇与TEM-30簇的亲缘关系最近。其次是SHV簇、KPC簇、AmpC簇。TEM-1簇与AmpC簇的亲缘关系最远（图2）。

图2 11种不同的β-内酰胺酶NJ系统发育树

3讨论

β-内酰胺酶是抗药性基因中重要的一类基因，大多数的抗药性基因β-内酰胺酶报道集中在土壤微生物领域研究和医学类的疾病防治研究。β-内酰胺酶作为抗性基因之一与cmlA、str、sul1、tetO基因共同协调作用调节微生物生态系统的微环境（11）。该基因的信息和蛋白结构在医学上对抗药性的二次污染和疾病防治尤其重要。基于β-内酰胺酶特殊的研究背景，同时随着生物信息学技术不断发展，一些新数据不断更新，我们将大肠杆菌中的β-内酰胺酶的基本信息进行系统分析，同时选择其它物种不同类型β-内酰胺酶进行进化分析，分析结果发现β-内酰胺酶比其它的抗性基因在物种间更加保守，β-内酰胺酶在一些物种的比对相似度达到99%以上，很多只有一个氨基酸不同。β-内酰胺酶物种间的保守性也说明在进化压力下β-内酰胺酶的功能以及涉及相关的机制在物种间是具有保守性。β-内酰胺酶的TEM类型、SHV类型和KPC类型中，在这些β-内酰胺酶每个类型内序列相似度都很高，有些序列信息基本相同或者只差一个氨基酸的区别，这些特点有可能是由于物种一定进化压力出现的突变体。

参考文献

1 Pruden A, Pei R, Storteboom H, Carlson K H. Antibiotic resistance genes as emerging contaminants: studies in northern Colorado[J]. Environmental Science and Technology, 2006, 40:7445-7450.

2 Abraham E P, Chain E. An enzyme from bacteria able to destroy penicillin[J]. Nature, 1940:146:837.

3 Wilke, M. S., Lovering, A. L., and Strynadka, N. C. (2005) -Lactam antibiotic resistance. A current structural perspective. Curr. Opin. Microbiol. 8, 525–533

4 Pimenta A C, Fernandes R, Moreira I S. Evolution of drug resistance:insight on TEM β-latamases structure and activity and β-lactam antibiotics[J]. Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, 2014, 14(2):111-122.

5 Hadjirin N F, Miller E L, Murray G G R, et al. Large-scale genomic analysis of antimicrobial resistance in the zoonotic pathogen Streptococcus suis. BMC Biology, 2021, 19:191.

6 Perez F, Endimiani A, HujerK K M. The continuing challenge of ESBLs. Current Opinion pharmacology, 2007, 7:459–469.

7 Fisher J F, Meroueh S O, Mobashery S. Bacterial resistance to β-lactam antibiotics. Compelling opportunism, compelling opportunity. Chemical Review, 2005, 105:395–424.

8 Bush K. Metallo-β-lactamases: a class apart. Clinical Infectious Diseases, 1998, 27(Suppl. 1):S48–S53

9 Montgomery S B, Sammeth M, Gutierrez-Arcelus M, et al. Transcriptome genetics using second generation sequencing in a Caucasian population. Nature, 2010, 464:773-777.

10 Babic M, Hujer A M, Bonomo R A.. What’s new in antibiotic resistance? Focus on β--lactamases. Drug Resist, 2006, Updat, 9:142–156.

11 Sun S, Lu C, Liu Juan, et al. Antibiotic resistance gene abundance and bacterial community structure in soils altered by Ammonium and Nitrate Concentrations. Soil Biology and Biochemistry, 2020, 149, 107965.