高同型半胱氨酸通过炎症及TGF-β1/Smad3信号通路诱导人肾小管上皮细胞转分化

 高同型半胱氨酸通过炎症及TGF-β1/Smad3信号通路诱导人肾小管上皮细胞转分化

林海雁 ,许宁 ,陈结慧 ,祝胜郎

华中科技大学协和深圳医院肾内科，广东深圳 518035

摘要：目的 研究高同型半胱氨酸在转化生长因子β1（TGF-β1）刺激的人近端肾小管上皮细胞（HK-2细胞）向间充质细胞转分化（EMT）中的作用及可能机制。方法 体外培养HK-2细胞，并分为正常对照组（control组）；同型半胱氨酸干预组（Hcy组）；TGF-β1干预组（TGF-β1组）；同型半胱氨酸+TGF-β1干预组（Hcy+TGF-β1组）。ELISA法、Western blot方法检测波形蛋白（vimentin）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、E-钙黏素（E-cadherin）、纤连蛋白（FN）、Smad3、单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）蛋白表达水平，实时定量PCR方法检测其mRNA表达水平。结果 在三个干预组中vimentin、α-SMA、FN、Smad3、MCP-1蛋白和mRNA表达水平均较对照组显著升高（P<0.001），E-cadherin表达显著降低（P<0.001），且随着时间延长，差异更加明显（P<0.001）。在分组比较，Hcy+TGF-β1组vimentin、α-SMA、FN、Smad3、MCP-1表达增加，E-cadherin表达降低最明显（P<0.05）。Hcy组MCP-1表达增加较TGF-β1组更明显（P<0.05）。结论 高同型半胱氨酸能够诱导体外培养的HK-2细胞表达vimentin、α-SMA、FN、Smad3、MCP-1增多，E-cadherin的表达减少，其作用可能是通过炎症及TGF-β1/Smad3信号通路实现。

关键词：同型半胱氨酸；人肾小管上皮细胞；慢性肾脏病；转分化；信号通路

慢性肾脏病(CKD)尽管病因各不相同，但在发展到终末期时，其共同的病理特征都是肾脏间质的弥漫性纤维化。在对肾脏纤维化发生机制的研究中，肾小管上皮细胞向间质样细胞转化(EMT)的发生机制及作用研究，无疑是研究的热点课题之一。肾脏是同型半胱氨酸（Hcy）代谢的主要部位，高同型半胱氨酸血症（HHcy）被认为是CKD的重要危险因素，最终可导致肾衰竭[1]。据报道，HHcy提高了肾小球系膜细胞和肾小管上皮细胞中单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）的产生，从而支持了HHcy诱发的肾损伤与其诱导炎症的能力有关。我们拟通过体外试验阐明HHcy在转化生长因子β1（TGF-β1）刺激的人近端肾小管上皮细胞（HK-2细胞）向间充质细胞转分化（EMT）中的作用及可能机制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 HK-2细胞培养

HK-2细胞购买自深圳承启医学公司，体外培养正常人近端肾小管上皮细胞（HK-2细胞），细胞长至80%融合时进行消化，调节细胞浓度至1×106/ml接种到六孔板。待细胞长至70%-80%融合时进行实验。

1.1.2 主要试剂

Vimentin Rabbit pAb（abclonal），α-Smooth Muscle Actin (ACTA2) Rabbit pAb （abclonal），E-Cadherin Rabbit pAb（abclonal），Fibronectin Rabbit pAb（abclonal），Smad3 Rabbit pAb （abclonal），MCP-1 Rabbit pAb（abclonal），同型半胱氨酸（阿拉丁），重组人TGF-β1蛋白（abclonal），vimentin、α-SMA、E-cadherin、FN、Smad3、MCP-1ELISA试剂盒（深圳承启医学公司）。

1.1.3 实验分组及干预

正常对照组（control组）；同型半胱氨酸干预组（Hcy组），加入1mmol/L的Hcy；TGF-β1干预组（TGF-β1组），加入10μg/L TGF-β1；同型半胱氨酸+TGF-β1干预组（Hcy+TGF-β1组），加入1mmol/L的Hcy及10μg/L TGF-β1。在1h，12h，24h，48h，72h收集细胞上清液，在24h，48h，72h收集细胞进行实验。

1.1.4 实验方法

ELISA法、Western blot方法检测蛋白水平，实时定量PCR方法检测mRNA水平；细胞上清液使用ELISA法检测vimentin，α-SMA，E-cadherin，FN，Smad3，MCP-1的表达。细胞使用Western blot方法检测vimentin，α-SMA，E-cadherin，FN，Smad3，MCP-1蛋白水平，时定量PCR方法检测vimentin，α-SMA，E-cadherin，FN，Smad3，MCP-1mRNA水平。

1.2 统计学分析

使用SPSS 23.0进行统计分析。所有数据釆用（均数±标准差）表示，采用重复测量的方差分析。P<0.05有统计学意义。

2 结果

2.1 各组vimentin、α-SMA、E-cadherin、FN、Smad3、MCP-1 mRNA的表达

control组、Hcy组、TGF-β1组、Hcy+TGF-β1组的α-SMA mRNA表达在72h达到高峰，分别为1.24±0.04，2.45±0.43，2.99±0.42，3.58±0.33。四组的E-cadherin mRNA表达在72h降至最低，分别为0.87±0.09，0.40±0.06，0.39±0.02，0.27±0.07。四组的FN mRNA表达在72h达到峰值，分别为1.31±0.18，1.96±0.15，2.45±0.12，2.52±0.33。四组的MCP-1 mRNA表达在72h达到峰值，分别为1.13±0.20，3.37±0.48，2.43±0.07，3.61±0.38。四组的Smad3 mRNA表达在72h达到峰值，分别为0.76±0.08，2.23±0.13，2.68±0.07，3.01±0.13。四组的vimentin mRNA表达在24h达到峰值，分别为0.78±0.20，1.46±0.10，1.62±0.33，1.64±0.31。各组时间效应有统计学意义（P<0.001），时间与分组交互效应有统计学意义（P<0.001）。综上，各组mRNA表达随时间变化的趋势不同，Hcy组及TGF-β1组均可以刺激vimentin、α-SMA、FN、Smad3、MCP-1 mRNA表达增加，E-cadherin mRNA表达减少，Hcy组以MCP-1 mRNA表达增加更明显，将其加入TGF-β1后对各指标作用更明显。组间比较control组vs Hcy组（P<0.05），Hcy组vs TGF-β1组（P<0.05），TGF-β1组vs Hcy+TGF-β1组（P<0.05）。

2.2 各组细胞vimentin、α-SMA、E-cadherin、FN、Smad3、MCP-1蛋白的表达

Western blot结果显示，control组、Hcy组、TGF-β1组、Hcy+TGF-β1组的α-SMA 蛋白表达在72h达到高峰，分别为0.52±0.02，1.07±0.09，1.56±0.21，1.84±0.11。四组的E-cadherin蛋白表达在72h降至最低，分别为0.87±0.09，0.34±0.07，0.29±0.09，0.25±0.07。四组的FN蛋白表达在72h达到峰值，分别为0.31±0.02，1.06±0.12，1.45±0.12，1.67±0.07。四组的MCP-1蛋白表达在72h达到峰值，分别为0.33±0.01，1.41±0.12，0.87±0.06，1.48±0.29。四组的Smad3蛋白表达在72h达到峰值，分别为0.46±0.03，1.33±0.10，1.48±0.15，1.77±0.09。四组的vimentin蛋白表达在24h达到峰值，分别为0.27±0.04，0.69±0.16，0.89±0.16，1.01±0.12。各组时间效应有统计学意义（P<0.001），时间与分组交互效应有统计学意义（P<0.001）。综上，各组蛋白表达随时间变化的趋势不同，Hcy组及TGF-β1组均可以刺激vimentin、α-SMA、FN、Smad3、MCP-1蛋白表达增加，E-cadherin蛋白表达减少，Hcy组以MCP-1蛋白表达增加更明显，将其加入TGF-β1后对各指标作用更明显。组间比较control组 vs Hcy组（P<0.05），Hcy组 vs TGF-β1组（P<0.05），TGF-β1组 vs Hcy+TGF-β1组（P<0.05）。

2.3 各组细胞上清液vimentin、α-SMA、E-cadherin、FN、Smad3、MCP-1蛋白的表达

ELISA结果显示，随着时间延长，Hcy组、TGF-β1组、Hcy+TGF-β1组的vimentin、α-SMA、FN、Smad3、MCP-1表达均较control组明显升高（P<0.001），E-cadherin的表达较control组明显下降（P<0.001），时间效应有统计学意义（P<0.001），时间与分组交互效应有统计学意义（P<0.001），说明Hcy组、TGF-β1组、Hcy+TGF-β1组在12h后各指标较control组开始出现差异（P<0.001），且随时间增加差异增大。其中Hcy组与TGF-β1组在α-SMA、FN蛋白表达无显著差异（P>0.05），Hcy组MCP-1蛋白表达较TGF-β1组增加（P<0.001），Hcy+TGF-β1组各蛋白表达变化较Hcy组及TGF-β1组更明显（P<0.001）。组间比较control组 vs Hcy组（P<0.05），Hcy组vs TGF-β1组（P<0.05），TGF-β1组vs Hcy+TGF-β1组（P<0.05）。

3 讨论

Hcy是一种含有巯基的氨基酸，是蛋氨酸代谢的中间产物。研究表明[2]，高同型半胱氨酸血症（HHcy）可引起内皮功能受损、血栓形成、胆固醇和甘油三酯合成代谢的紊乱以及单核细胞的活化，从而参与硬化性疾病，包括肾小球硬化的发生和发展。HHcy可直接引起足细胞损伤进而导致肾小球硬化，而脂筏簇集继发的NADPH氧化酶激活及NALP3炎症小体的形成和活化是HHcy所致足细胞损伤的关键分子机制。HHcy引起炎症潜在的机制可能是Hcy促进肾小球系膜细胞MCP-1的表达。在肾小球系膜细胞中，Hcy能通过NF-κb的激活促进MCP-1的蛋白和mRNA表达水平的增高。近期有研究发现Hcy与IgA肾病的早期肾小管间质损伤相关，是它的独立危险因素[3]。有动物实验发现通过口服蛋氨酸促发高同型半胱氨酸血症能诱导肾间质纤维化，其机制可能与肾小管上皮细胞的异常增殖及肾小管上皮转分化有关[4]。为此本研究通过体外试验阐明HHcy在TGF-β1刺激的HK-2细胞向间充质细胞转分化（EMT）中的作用及可能机制。

众所周知，TGF-β1/Smads信号通路在肾脏纤维化发生、发展过程中发挥至关重要作用。TGF-β1通过激活下游因子Smad3以刺激单核细胞向成纤维细胞的转变，进而促进肾脏纤维化。在本研究中，Hcy组的Smad3 mRNA及蛋白表达均较对照组显著升高，细胞上清液蛋白表达也明显升高，间接提示Hcy可能激活了TGF-β1/Smad3信号通路。但其作用较单独添加TGF-β1稍弱，可能需要进一步实验研究不同浓度Hcy诱导TGF-β1表达的情况。本研究也证实了Hcy可以诱导肾小管上皮细胞产生大量vimentin、α-SMA、FN，使E-cadherin表达明显减少，这些都能促进肾小管上皮细胞EMT。此外，在本研究中还发现Hcy可以诱导MCP-1表达明显增加，这种作用较单独添加TGF-β1更强，MCP-1为炎症趋化因子，提示Hcy可能参与诱发炎症，促进肾小管上皮细胞EMT。在本研究中还发现Hcy与TGF-β1有协同作用，可以明显增加vimentin、α-SMA、FN、Smad3的表达，减少E-cadherin的表达，这可能是由于Hcy能够激活TGF-β1/Smad3信号通路，以及Hcy能够激活炎症因子MCP-1。本研究的不足之处是没有检测TGF-β1的表达情况，因此无法得知Hcy刺激HK-2细胞后TGF-β1的表达水平，仅仅只能通过下游因子Smad3来间接说明可能激活了TGF-β1/Smad3信号通路。

总之，我们的研究证实了高同型半胱氨酸能够诱导体外培养的HK-2细胞表达vimentin、α-SMA、FN、Smad3、MCP-1增多，E-cadherin的表达减少，其作用可能是通过炎症及TGF-β1/Smad3信号通路实现。

参考文献

[1]Ostrakhovitch EA,Tabibzadeh S.Homocysteine in Chronic Kidney Disease[J].Advances in clinical chemistry,2015,72:77-106.

[2]Eikelboom JW,Lonn E,Genest J,et al.Homocyst(e)ine and cardiovascular disease: a critical review of the epidemiologic evidence[J].Ann Intern Med,1999,131(5):363-375.

[3]Li Z,Han Q,Ye H,et al.Serum homocysteine is associated with tubular interstitial lesions at the early stage of IgA nephropathy[J].BMC nephrology,2022,23(1):78.

[4]王成艳,赵东岳,胡兴亚.口服蛋氨酸造成的大鼠肾间质纤维化模型及其机制研究[J]. 海峡科学,2015(11):28-30,6.

基金项目：深圳市南山区科技计划项目一般项目（2020065）

作者简介：林海雁，男，籍贯：福建泉州，学历：硕士研究生，职称：主治医师，研究方向：慢性肾小球肾炎临床与病理。