两种抗中性粒细胞胞浆抗体检测方法的结果相关性分析

两种抗中性粒细胞胞浆抗体检测方法的结果相关性分析

杨霄,吴晓玲,韩亚荣,李永霞,张维（通讯）

（西安金域医学检验所有限公司，陕西  西安，710018）

摘要目的： 分析两种抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)检测方法的阳性率、性别及年龄差异情况，评价两种方法的一致性和互补性。方法 ：收集送至本实验室的12613例ANCA检测结果，分析两种检测方法的阳性率差异及阳性病例性别和年龄分布情况，采用间接免疫荧光法(IIF)和免疫印迹法检测ANCA。结果 ：12613例样本中，共检出1263例ANCA阳性，阳性率10.01%，其中核周型(p-ANCA) 阳性784例(6.22%)，抗髓过氧化物酶抗体(MPO-ANCA)322例( 2.55%)、胞浆型(c-ANCA)119例(0.94%)、抗蛋白酶3抗体(PR3-ANCA)38例(0.30%)，IIF法和免疫印迹法的阳性率有显著差异(P<0.05) ，p-ANCA的阳性率高于c-ANCA，MPO-ANCA的阳性率高于PR3-ANCA，差异有统计学意义(P<0.05)。男女阳性检出率无显著性差异（P>0.05），不同年龄段的阳性检出率无显著差异(P>0.05)。结论 ：两种检测方法的结果一致性较低，且IIF的阳性率高于免疫印迹法。由于检测方法上的差异，IIF法可作为 ANCA相关疾病的初筛试验，免疫印迹法可用于特异性诊断，临床上可根据需要灵活选择检测项目和方法。

关键词 抗中性粒细胞胞浆抗体；间接免疫荧光法；免疫印迹法；结果分析

中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)是一组以人中性粒细胞胞浆成分为靶抗原，与临床多种小血管炎性疾病密切相关的自身抗体，现已证实该抗体是系统性血管炎的血清标志性抗体，对血管炎的诊断、分类及预后具有重要意义[1]。主要的ANCA有两种类型，胞浆型(c-ANCA)和核周型(p-ANCA), c-ANCA针对的主要靶抗原是蛋白酶3(PR3)，p-ANCA针对的主要靶抗原是髓过氧化物酶(MPO) [2]，MPO和PR3在参与小血管炎的发病中起着重要作用，它们可以激活中性粒细胞导致脱颗粒反应，使大量的蛋白水解酶活化，作用于小血管壁，并在其他免疫介质的协同作用下造成血管炎症[3]。根据1999年发布的一项国际共识声明，间接免疫荧光(IIF)应作为一种检测ANCA的初筛方法，而MPO-ANCA和PR3-ANCA应被用来检测特异性抗体[4]。本文通过收集IIF和免疫印迹法同时检测的12613例临床血清样本的ANCA检测结果，比较两种方法的阳性率差异，并进一步了解阳性病例的性别和年龄分布规律，评估两种方法的差异与相关性，为临床诊治中检测项目和方法的选择提供参考依据。

1. 资料

1.1一般资料 

收集了2019年6月1日至2022年5月31日期间12613例送本实验室检测中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)的血清样本的检测结果，其中男性6681例，女性5932例，患者年龄在9-99岁之间，平均年龄55岁。

1.2 仪器 德国HELIOS全自动间接免疫荧光法分析仪；深圳雷杜Blotray-866自动蛋白印迹仪;日本奥林巴斯株式会社BX43荧光显微镜。

1.3试剂 抗中性粒细胞胞浆抗体检测试剂盒（间接免疫荧光法）购自德国雅仕通诊断有限两合公司；抗髓过氧化物酶抗体，抗蛋白酶3抗体检测试剂盒购自江苏浩欧博生物医药股份有限公司。

2. 方法
   1. 实验方法 ：回顾12613例样本的ANCA检测结果，分析IIF和免疫印迹法的阳性率差异，并对男女阳性检出率差异及年龄分布情况进行分析。采用间接免疫荧光法（IIF）检测ANCA的荧光模型，分为p-ANCA和c-ANCA两种类型。免疫印迹用以检验MPO-ANCA和PR3-ANCA。
   2. 数据分析：使用SPSS statistics 25软件进行统计分析，采用X2检验和单因素ANOVA分析，P<0.05表示差异有统计学意义。
3. 结果

采用IIF和免疫印迹法同时检测12613例标本，共检出ANCA阳性1263例，阳性率10.01%，IIF法阳性903例(7.16%)，其中，p-ANCA 阳性784例(6.22%)，c-ANCA阳性119例 (0.94%)， 免疫印迹法阳性360例 (2.85%)，包含MPO-ANCA阳性322例( 2.55%)，PR3-ANCA阳性38例(0.30%)，IIF阳性率高于免疫印迹法，差异有统计学意义 (X2=245.756，P<0.05)。其中，p-ANCA的阳性率较c-ANCA高，MPO-ANCA阳性率高于PR3-ANCA，p-ANCA阳性率高于MPO-ANCA，c-ANCA阳性率高于PR3-ANCA，差异均有统计学意义(X2=507.910，X2=227.288，X2=201.837，X2=42.052，P<0.05)(见表1)。p-ANCA和MPO-ANCA同时阳性265例(2.10%)，p-ANCA阳性MPO-ANCA阴性519例(4.11%)，p-ANCA阴性MPO-ANCA阳性57例(0.45%)，c-ANCA和PR3-ANCA同时阳性26例(0.21%)，c-ANCA阳性PR3-ANCA阴性93例(0.74%)，c-ANCA阴性，PR3-ANCA阳性12例(0.10%)(见表2)。送检样本中，男性6681例，检出率7.86%，女性5932例，检出率12.44%，男女阳性检出率比较，差异无统计学意义（P<0.05）(见表3)。除此之外，在收集到的病例中，30岁以下1105例，检出率为4.34%，30-50岁2811例，检出率为7.93%，50岁以上6972例，检出率为14.32%，不同年龄组的阳性检出率无明显差异（P<0.05）(见表4)。

表1. ANCA阳性检出情况

表2. IIF与免疫印迹法检测ANCA结果比较

表2. ANCA阳性病例性别构成情况

表3. ANCA阳性病例年龄构成情况

4讨论

抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)相关性小血管炎(AAV)是一种常见的自身免疫性疾病，主要包括肉芽肿性多血管炎(GPA)、显微镜下型血管炎(MPA)及嗜酸性肉芽肿性多血管炎(EGPA)[5,6]。 已有研究证明, AAV的发生机制与ANCA对白细胞的过度活化导致细胞因子、活性氧及裂解酶的释放有关[7]。血管炎以普遍的血管壁炎性反应和纤维素样坏死为主要临床症状，血管壁的炎性反应和慢性纤维素样坏死会导致血管内皮细胞损伤和血栓形成[8,9]，导致呼吸道和肾脏发生病理性改变，严重者危及患者生命[10]。ANCA是血管炎的特异性血清诊断抗体，也是判断病情活动和复发的重要根据[11]。现已建立了包括间接免疫荧光法、酶联免疫吸附法、化学发光法、荧光酶免疫吸附法及多重微珠法等多种ANCA的检测方法[12]。

本次研究采用间接免疫荧光法检测ANCA，底物基质包括乙醇和甲醛固定的人中性粒细胞，乙醇固定的中性粒细胞可呈现两种形态的荧光模型：胞浆型荧光（c-ANCA）和核周型荧光（p-ANCA），甲醛固定的中性粒细胞用以协助判断抗核抗体(ANA)对ANCA的干扰。由于以上两种核型均可能包被多种类型的抗原，需结合另外一种方法进行验证，因此，我们使用免疫印迹法检测MPO-ANCA和PR3-ANCA，结果 12613例临床标本中， IIF法阳性903例，阳性率7.16%，免疫印迹法阳性360例，阳性率2.85%，IIF阳性率明显高于免疫印迹法, 差异有统计学意义（p<0.05）。IIF法阳性病例中，p-ANCA阳性784例，阳性率6.22%，c-ANCA阳性119例，阳性率0.94%，p-ANCA阳性率较c-ANCA高，差异有统计学意义（p<0.05）。由于 p-ANCA和c-ANCA的最主要的靶抗原分别是MPO和PR3[2]，因此我们分别比较了p-ANCA与MPO-ANCA，c-ANCA与PR3-ANCA的阳性率差异，结果显示两组差异均有统计学意义（p<0.05），且p-ANCA和c-ANCA的阳性率分别高于MPO-ANCA和PR3-ANCA。此外，我们统计了IIF法和免疫印迹法阳性符合情况，结果发现两种方法同时阳性291例，阳性率2.31%，占阳性病例的23.04%，结合两种方法的阳性率差异不难看出IIF法与免疫印迹法阳性符合率不理想。由于间接免疫荧光法灵敏度高但特异性较低，易受血清中的非特异性抗体干扰造成假阳性，而免疫印迹法灵敏度低但特异性高，可避免一些干扰抗体造成的假阳性[13]，且IIF结果判断主观性较大，受荧光显微镜的设置影响较大，易造成结果差异[14]。因此，两种方法之间的阳性率差异可能由于方法学上的差异所致。为了解阳性患者的性别和年龄分布，我们统计了阳性病例中不同性别和年龄段的阳性检出率，结果表明，性别和年龄组的阳性检出率差异均无统计学意义(P<0.05)。

综上所述，抗中性粒细胞浆抗体的间接免疫荧光法与免疫印迹法检测结果一致性较低，IIF法阳性率显著高于免疫印迹法，p-ANCA的阳性率最高。另外，p-ANCA阳性率高于C-ANCA，MPO-ANCA高于PR3-ANCA ，p-ANCA高于MPO-ANCA，c-ANCA高于PR3-ANCA。阳性患者的性别和年龄无显著性差异。由于检测方法上的差异，结合本次分析结果，建议IIF法用于初筛而免疫印迹法用于特异性诊断，临床上可根据需要灵活选择，以减少ANCA相关血管炎的漏诊和误诊，提高检测的准确性和经济性。

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