云浮种植南药——小叶榕HPLC指纹图谱研究

云浮种植南药——小叶榕HPLC指纹图谱研究

陈晓涛黄海珍李依信付珑

云浮市食品药品检验所  广东云浮  527300

摘要　目的：利用高效液相色谱法对云浮种植的小叶榕叶的指纹图谱进行研究为云浮种植的小叶榕叶药材的鉴别和质量控制提供可靠的科学依据。方法：以异牡荆苷为对照品测定不同产地的 7个样品的色谱图谱。结果：小叶榕叶中所含成分的各色谱峰均得到了有效的分离在指纹图谱中共有峰有9个能有效的用于鉴定小叶榕叶。结论：该方法具有较强的特征性及专属性可以为云浮不同产地种植的小叶榕叶药材的鉴定及质量控制提供科学依据。

关键词：小叶榕；指纹图谱；高效液相；云浮南药 

小叶榕，又名细叶榕、正榕、落地金钱榕，来源于桑科榕属植物榕树叶。小叶榕是民间常用药材，味苦、性寒。作用于肝、肺、大肠，具有清热解毒、消肿、祛湿止痛的功效〔1〕。本项目拟采用 HPLC法对云浮地区不同产地的小叶榕叶片进行指纹图谱构建与分析，从而为其在生产过程中的质量控制提供全面的科学依据，切实保证相关产品的质量稳定性。

1　试药与仪器

1.1　试药  本实验小叶榕叶药材采自云浮市新兴和罗定市7个种植地，所有样品由云浮市食品药品检验所副主任中药师李依信鉴定为桑科榕属植物榕树 （FicusmicrocarpaL.f.）的叶，见表1。异荭草苷对照品（批号：111974-201401，含量以94.0%计）、牡荆苷对照品（批号：111687-202105，含量以99.1%计）、异牡荆苷对照品（批号：112097-202201，含量以100.0%计）均购自中国食品药品检定研究院。色谱纯甲醇（天津四友）水为超纯水其他试剂均为分析纯。

1.2　仪器  日本岛津LC-20AT高效液相色谱仪（SIL-20A自动进样器，CTO-20AC柱温箱，SPD-M20A检测器，FCV-11AL管路切换器），梅特勒托利多XS205DU十万分之一天平，色谱柱：长柱kromasilcC18柱（4.6mm×250mm，5μm），短柱kromasilcC18柱（4.6mm×150mm，5μm）。

2　方法与结果

2.1　色谱条件

使用kromasilcC18色谱（4.6毫米x250毫米、5微米）；流动相A：甲醇， 流动相B：0.05%磷酸水溶液，按照表2所示的时间浓度变化进行梯度洗脱操作。测定波长335 nm,柱温为35℃，流速为1.0毫升/分钟。根据异牡荆苷峰的分析，其理论板数不能少于5000。进样体积则为10微升。

2.2对照品的配制

取异荭草苷对照品，牡荆苷对照品，异牡荆苷对照品各一定量，用70%的甲醇配制1 mL含有异荭草苷20μ g、牡荆苷10μ g、异牡荆苷50μ g的混合对照液。

2.3样品的配制

使用高速打粉机将小叶榕叶粉碎并通过四号筛，精密称取粉末1克，置于有塞的锥形瓶中，用移液管精密量取50毫升70%的甲醇溶液加入到锥形瓶中，密封，轻轻振摇，称定总重量。然后进行超声波处理（功率250 W，频率40 kHz)60 min，冷却后再称定总重量，用70%的甲醇溶液补充所失去的重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

表1   药材来源

样品编号                  产地                     采收时间

  S1                新兴稔村镇坝塘村                2023.05

S2                新兴六祖镇丰坊村                2023.04

S3                新兴 东城镇都村                 2023.05

S4                 新兴六祖镇白村                 2023.04

S5             新兴云水谣南药种植基地             2023.07

S6                 罗定金鸡镇                     2023.06

S7                罗定龙湾镇大石村                2023.08

表2  梯度洗脱表

时间（min）           流动相A（%）            流动相B（%）

0～55                 25→35                   75→65

55～56                35→25                   65→75

56～65                25→35                   75→65

2.4  空白试验  吸取70%甲醇溶液，按“2.1”色谱条件进样测试，记录色谱图，结果见图1。由图1可知，溶剂对测定无干扰。

2.5  参照物的确定  取“2.2”“2.3”项的溶液，按“2.1”色谱条件进样测试，记录色谱图，结果见图1。由图1可见，对照品溶液和供试品溶液中，异牡荆苷峰分离度、峰形、响应值都较好，因此确定以异牡荆苷作为参照物。

图1  空白实验及对照品和供试品色谱图

2.6方法学考察

2.6.1 精密度试验

取中药样本S1按“2.3”中的步骤处理，制备供试品溶液，并进行6次的进样操作，测定其指纹图谱。结果所有的色谱峰的相对峰面积及相对保留时间的RSD都在2%以下，说明本实验使用的高效液相色谱仪精密度良好，满足要求。

2.6.2重复性试验

取同一批小叶榕叶样品 6份，按照“2.3”中的步骤处理，制备供试品溶液，测定其指纹图谱，结果每个主要共有峰比峰面积及相对保留时间 RSD都在2%以内，说明该方法具有较好的重现性，满足指纹图谱的需要〔2〕。

2.6.3稳定性测定

取药材样品按照“2.3”中的步骤处理，制备供试品溶液分别在 0、2、4、8、12、24h检测指纹图谱。结果各主要共有峰相对峰面积和相对保留时间RSD均不超过2％说明供试品溶液在 24h内稳定性良好。

2.7各地区小叶榕叶片指纹图的构建

取不同产地的7批小叶榕叶药材，按照“2.3”中的步骤处理，制备供试品溶液，并根据“2.1”的色谱条件采集样品，并将其绘制于图2中。结果表明，7批次中药的指纹谱图上，共有25个峰，9个为7批次的指纹图谱所共有。9号峰是异牡荆苷组分，以它为参考峰，求出了其它峰的相对保留时间及相对峰面积，如表3和4所示。

图2  不同产地药材色谱图叠加

表3  不同产地药材色谱图指纹图谱共有峰的相对保留时间

表 4   不同产地药材色谱指纹图谱共有峰的相对峰面积

运用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）”分析比较图谱数据以中位数法，时间窗宽度设为0.1，进行多点校正，选出9个具有良好分离性、峰型和峰高的色谱峰为共同峰，选择mark峰匹配，生成对照指纹图谱，见图3。以对照图谱为参照对7批药材图谱的相似度进行评价见表5。从相似度结果可以看出7批样品的相似度超过0.99的有4个,还有3个样本的相似程度超过0.92。这表明，因为地域的原因，这些小叶榕叶的化学组成和含量都比较稳定，但是也会有一些细微的差别。

图3  不同产地药材色谱图及对照指纹图谱

表5   7批药材相似度评价结果

3 讨论

通过对超声、加热回流等差异化提取方法、提取时间（15、30、60 min)、提取溶剂（水、50%甲醇、70%甲醇、70%乙醇、95%乙醇、无水乙醇）、流动相（甲醇-水、甲醇-0.05%磷酸水溶液、乙腈-水、乙腈-0.05%磷酸水溶液）、检测波长（270、320、335 nm）、柱温（30、35、40、45℃）、流速（0.7 mL/min、1.0 mL/min）和2个不同长度的色谱柱等测定条件，优选出“2.1”项目下的色谱条件。

本次试验采集7个产地的药材样品，其相似性范围为0.928-0.998，平均0.983，综合分析药材产地、生长年限、种植过程中水分、肥料和光照条件等因素，确定药材与药材的相似性下限不小于0.90。现有的小叶榕标准〔3〕，规定以单一对照品牡荆苷进行实验，以牡荆苷峰为参照，确定相对保留时间1.3±5%的物质为异牡荆苷峰，相对校正因子0.93，按干燥品计算每1g含牡荆苷和异牡荆苷的总量，实验中发现，小叶榕提取物中牡荆苷的色谱峰比异牡荆苷峰峰面积小很多，而且牡荆苷出锋前后都有其它物质峰，若实验色谱条件选择不当，容易造成牡荆苷峰与其他峰堆叠在一起，难以判断，影响测定结果真实性，因此今后将收集更多样品进一步研究以牡荆苷和异牡荆苷双对照品作参照，以峰面积外标法测定小叶榕干燥品中牡荆苷和异牡荆苷的总量。

小叶榕的主要成分为三萜、黄酮、甾体类等。我们前期研究发现，小叶榕提取物中的异荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷等具有抑制3型副流感病毒及 RSV的活性，减轻病毒性炎症的功效，止咳、抗炎、镇痛效果突出〔4-6〕。异牡荆苷是其主要活性成分，具有抗痉挛、抗感染、降血压等功效。小叶榕叶化学成分（指纹图谱）是其质量控制的有效指标〔7-9〕，为确保其安全、疗效稳定，需要对其进行全面评价。本研究以异牡荆苷为参照物，对云浮不同产地小叶榕叶片的指纹图谱进行分析比较，为云浮地区小叶榕的鉴别、采收、加工和用药质量控制提供科学依据。

参考文献

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