简介:摘要肝癌干细胞(LCSCs)定义为存在肝癌组织中一小部分具有自我更新能力和异质分化潜能的细胞。随着对肝癌发生机制研究的深入,肝癌干细胞驱动理论作为致癌机制之一被提出,而肝癌干细胞的研究重中之重就是如何分选及培养。目前,肝癌干细胞的分选主要基于与非肝癌干细胞的免疫表型和功能特性的差异:利用细胞表达生物标志物分选的方法有荧光激活细胞分选法(FACS)、免疫磁珠分选法(MACS)、激光捕获显微镜切割技术(LCM)等;基于功能特性分选的方法有边缘群细胞分选法、密度梯度离心富集法、无血清培养肿瘤球形成法、荧光标记保留法等,以及待进一步研究的更有利于肿瘤干细胞分选的微流控技术及三维细胞培养体系。本文将对近年来肝癌干细胞的分选方法做一个综述,探讨未来肝癌干细胞分选的研究趋势。
简介:目的建立肝癌耐药细胞株,并观察耐药细胞株癌干细胞的相关生物学特性。方法采用阿霉素(ADM)浓度梯度递增法诱导建立耐药BEL-7404人肝癌细胞株,并对亲代与耐药肝癌细胞株进行癌细胞基本特性、癌于细胞相关细胞学特性进行检测,用计数法检测癌细胞生长曲线、倍增时间与MTT法测耐药倍数;单个细胞成株培养、平板克隆形成实验、“球囊”细胞培养实验。结果耐药BEL-7404人肝癌细胞与亲本细胞相似,呈上皮样生长方式,但其中梭状细胞略多,耐药倍数为292倍;生长曲线表明其增殖速度明显低于亲本BEL-7404人肝癌细胞,且倍增时间增加;耐药BEL-7404肝癌细胞克隆形成率、“球囊”细胞形成率均明显低于其亲本BEL-7404人肝癌细胞。结论低浓度阿霉素持续增量法可诱导形成耐药肝癌细胞株,但耐药肝癌细胞株的癌干细胞特征并不明显。
简介:目的:研究肝癌细胞系SMMC7721肿瘤干细胞表面标志物,探讨细小病毒H-1非结构蛋白NS-1对肝癌细胞的生长抑制作用,以及其对肝癌细胞中具有干细胞特性群体的影响。方法:用流式细胞仪将肝癌细胞按细胞表面标志CD133、CD44进行分离,分为CD133+CD44+、CD133+CD44-、CD133-CD44+、CD133-CD44-4个群体,采用脂质体法将细小病毒H-1非结构蛋白NS-1质粒转染入人肝癌细胞SMMC7721,采用G418筛选稳定转染的细胞克隆,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测转染细胞NS-1基因的表达。流式细胞仪分析SMMC7721转染前后肿瘤干细胞表面标志CD133、CD90、CD44的表达和细胞生长周期,检测细胞群体的变化。以裸鼠成瘤实验和软琼脂克隆形成实验评价具肿瘤干细胞性质的肝癌细胞表面标志物以及细小病毒H-1非结构蛋白NS-1转染对肝癌细胞生长的影响。结果:肝癌SMMC7721细胞分成CD133+CD44+、CD133+CD44-、CD133-CD44+、CD133-CD44-4组亚群的细胞存在着异质性,4组亚群细胞中均有少数肿瘤干细胞样细胞能在软琼脂上形成克隆,其中CD133+CD44+、CD133+CD44-亚群克隆形成率分别为3.5%和1.8%,CD133-CD44+、CD133-CD44-亚群克隆形成率为0.7%和0.5%。转染细小病毒H-1非结构蛋白NS-1后,4组亚群细胞克隆的形成率都显著下降。裸鼠成瘤实验提示,CD133+表型的细胞成瘤能力强于CD133-表型细胞,CD133-CD44+亚群细胞成瘤能力最弱。流式细胞仪分析显示转染NS-1后,CD133+群体细胞被明显抑制,由31.9%下降至6.3%,而CD90+和CD44+的表达未出现改变;转染NS-1后细胞S期百分率明显下降。结论:肝癌细胞表型为CD133+CD44+和CD133+CD44-亚群中富含肝癌干细胞,转染细小病毒H-1非结构蛋白基因NS-1的部分亚群SMMC7721细胞生长被抑制,提示其对肝癌细胞株中具有干细胞特性的CD133+群体有一定的抑制效应。
简介:目的:建立高转移肝癌细胞株,研究其肿瘤干细胞生物学特征,为靶向人肝癌干细胞治疗提供有价值的细胞模型。方法:肝癌细胞系Bel7402接种裸鼠皮下,成瘤后,取小鼠肺部转移灶,通过机械分离法,获取肺部肝转移细胞,体外扩大培养后,再次接种裸鼠。如此反复接种裸鼠,获得稳定肺转移肝癌细胞株Bel7402-V13。采用无血清悬浮培养及PKH26染色确定Be17402-V13中肿瘤干细胞的存在。流式细胞术分析亲本Bel7402和Bel7402-V13中肿瘤干细胞标志物ESA的表达情况,分选Bel7402和Bel7402-V13中ESA+细胞并进行体外生物学特征研究及裸鼠致瘤实验。结果:建立高转移Bel7402-V13细胞株,Bel7402-V13细胞无血清悬浮培养7d后形成的细胞球体中存在单个PKH26阳性细胞。与Bel7402中ESA+细胞相比,流式分析显示干细胞标志物[3人比例高转移丑<;17402-V13显著提高5.67倍(17.6±0.4¥33.1±1.5)。3(;17402-V13中ESA+细胞具有更强的自我更新能力[成球率:(94.8±7.5)%vs(52.3±6.9)%,P<0.01],侵袭能力提高1.51倍(397.7±79.4v262.0±40.1,P<0.01),耐药能力也显著增强(IC5。:0.286v0.196,P<0.01),ESA+细胞Bel7402-V13在裸鼠皮下接种2xl02个细胞3月即可致瘤(3/6),而接种2xl02个ESA+细胞Bel7402细胞3月才能致瘤(1/6)。结论:获得高转移肝癌细胞株Be17402-V13,伴随ESA+细胞增加,其体内外功能显著增强,为肝癌干细胞的靶向治疗提供有价值的细胞模型。
简介:摘要目的筛选肝癌干细胞来源外泌体中差异表达的miRNA并分析其对肝癌细胞恶性生物学特征的影响。方法采用miRNA表达谱芯片分析肝癌干细胞来源外泌体中差异表达的miRNA并鉴定miRNA对肝癌干细胞恶性表型的作用。采用不同浓度(0、150、300 μmol/L)多柔比星处理细胞,采用实时定量PCR(qRT-PCR)检测miR-196a表达水平的变化;分别采用肝癌干细胞来源外泌体(Exo-NC组)、转染miR-196a抑制剂处理后的外泌体(Exo-Inhibitor组)培养肝癌细胞,检测肝癌细胞的凋亡情况以及caspase3/7的活性。按照随机数字表法将裸鼠分为Do-PBS组、Do-Exo-Inhibitor组、Do-Exo-NC组,每组各5只,采用裸鼠移植瘤实验分析miR-196a对肝癌细胞裸鼠移植瘤模型的作用。结果本研究分离纯化了CD133+ Huh7干细胞培养上清中的外泌体,发现miR-7162-3p、miR-1910-5p、miR-3613-3p、miR-196a、miR-155-5p表达上调,miR-1246和miR-3613-5p表达下调。外泌体中miR-7162-3p、miR-196a和miR-155-5p对肝癌干细胞的自我更新能力具有重要影响;miR-1910-5p、miR-196a和miR-155-5p对肝癌干细胞的侵袭能力具有重要影响,其中miR-196a的抑制效果最显著。在反应24 h时,多柔比星浓度在0、150、300 μmol/L时miR-196a的表达量分别为0.96±0.05、1.23±0.05和2.33±0.03,差异具有统计学意义(F=996.90,P<0.001);48 h时,多柔比星浓度在0、150、300 μmol/L时miR-196a的表达量分别为1.02±0.07、2.35±0.05和2.89±0.55,差异具有统计学意义(F=303.00,P<0.001)。Exo-NC组肝癌细胞在多柔比星浓度为0和300 μmol/L时的细胞凋亡率分别为9.37%±0.19%和11.64%±0.27%,Exo-Inhibitor组分别为18.80%±1.91%和22.79%±1.57%,差异均具有统计学意义(t=4.41,P=0.048;t=4.96,P=0.038)。未使用多柔比星处理时,Exo-NC组在24 h和48 h的caspase3/7比值分别为0.94±0.08和0.97±0.09,Exo-Inhibitor组分别为1.56±0.01和1.58±0.01,差异均具有统计学意义(t=11.41,P=0.008;t=6.07,P=0.026)。使用300 μmol/L多柔比星处理细胞后,Exo-NC组在24 h和48 h的caspase3/7比值分别为0.95±0.07、1.36±0.08,Exo-Inhibitor组分别为2.84±0.08、3.20±0.14,差异均具有统计学意义(t=24.20,P=0.002;t=15.78,P=0.004)。Do-PBS组、Do-Exo-Inhibitor组和Do-Exo-NC组3组裸鼠的移植瘤体积依次增大,分别为(1 051.86±89.90)mm3、(1 310.91±86.66)mm3和(2 185.14±352.34)mm3,差异具有统计学意义(F=30.28,P<0.001);3组移植瘤重量依次增加,分别为(0.36±0.10)g、(0.39±0.12)g和(0.76±0.16)g,差异具有统计学意义(F=11.81,P=0.002);转染miR-196a抑制剂后裸鼠移植瘤肿瘤内miR-196a的表达显著降低,3组表达量分别为1.05±0.16、0.38±0.08和2.17±0.26,差异具有统计学意义(F=48.93,P<0.001)。结论肝癌干细胞分泌的外泌体可通过其中的miR-196a增强肝癌细胞对多柔比星的耐药性。
简介:干细胞研究的热度上升与克隆羊"多利"直接相关."多利"诞生后在伦理道德上引起争议,各国政府纷纷表态禁止克隆人.为此,相关领域的科学家相继转移了科研方向,大多开始了干细胞工程对器官移植和疾病治疗价值的探索.
简介:摘要目的探讨靶向肝癌干细胞的紫杉醇纳米粒的制备及其对肝癌HepG2细胞(CD133阳性亚群占8%)和Huh-7细胞(CD133阳性亚群占65%)的效果。方法应用单乳溶媒挥发法制备聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物装载的紫杉醇纳米粒,采用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺(EDC/NHS)交联法制备由抗CD133抗体修饰的紫杉醇纳米粒,即靶向纳米粒。检测纳米粒的表征及理化特性(包封率和载药率、粒度分布、形态、体外释放)。将肝癌Huh-7和HepG2细胞与紫杉醇纳米粒或靶向纳米粒共培养,应用流式细胞术分析肝癌细胞对纳米粒的摄取和累积,并检测CD133阳性细胞比例,应用平板克隆形成实验分析细胞存活情况。结果扫描电镜检测显示,靶向纳米粒的粒径为(429.26±41.53)nm,Zeta电位为-11.2 mV,具有球形形态和较高的包封率[(87.53±5.90)%]。流式细胞术检测显示,37 ℃时,Huh-7细胞靶向纳米粒组的荧光强度较紫杉醇纳米粒组荧光强度高(13 397±720比6 898±604),差异有统计学意义(P<0.05);37 ℃时,HepG2细胞紫杉醇纳米粒和靶向纳米粒组间荧光强度差异无统计学意义(7 899±343比8 432±516,P>0.05)。Huh-7细胞靶向纳米粒组CD133阳性细胞比例较紫杉醇纳米粒组低[(15.7±2.6)%比(54.9±7.4)%],差异有统计学意义(t=7.31,P=0.008);HepG2细胞两组间差异无统计学意义(P>0.05)。平板克隆形成实验结果显示,靶向纳米粒作用后,各时间点Huh-7细胞存活率低于紫杉醇纳米粒作用后,差异有统计学意义(F=5.56,P=0.009);紫杉醇纳米粒和靶向纳米粒作用后,HepG2细胞存活率差异无统计学意义(F=1.19,P=0.142)。结论制备的靶向肝癌干细胞的纳米粒对肝癌Huh-7细胞有良好抑制作用。
简介:摘要目的探讨人脐带间充质干细胞条件培养基(UCMSC-CM)对肝癌细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭的影响及其机制。方法体外培养肝癌细胞系HepG2和BEL-7402,常规培养肝癌细胞系作为对照组,UCMSC-CM处理的肝癌细胞系作为UCMSC-CM组。采用细胞增殖与毒性检测(CCK-8)法检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡;划痕试验和Transwell侵袭试验分别检测细胞迁移和侵袭能力;Western blot检测细胞中糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)、p-GSK-3β、Bak、Bax、兔抗人大分子B淋巴细胞瘤蛋白(BCL-XL)、髓细胞白血病-1蛋白(MCL-1)、存活素蛋白表达;实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测细胞中上皮间质转化(EMT)相关标志物mRNA的表达水平。结果CCK-8法检测结果显示,UCMSC-CM处理HepG2细胞和BEL-7402肝癌细胞24、48、72 h后的光密度值与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05);流式细胞术检测结果显示,UCMSC-CM组与对照组处理HepG2、BEL-7402细胞早期(Q4)、晚期(Q2)凋亡率比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。UCMSC-CM处理组处理HepG2细胞24、48 h后划痕愈合面积百分率[(53.00±2.45)%、(87.33±1.25)%]均高于对照组[(21.00±2.45)%、(43.67±4.64)%],差异有统计学意义(P<0.05);UCMSC-CM处理组处理BEL-7402细胞48 h后划痕愈合面积百分率[(65.33±11.26)%]高于对照组[(36.67±8.81)%],差异有统计学意义(P<0.05)。侵袭试验结果显示,UCMSC-CM处理HepG2细胞24 h后,UCMSC-CM组侵袭细胞数[(630.00±62.33)个]高于对照组[(386.00±42.53)个],差异有统计学意义(P<0.05);UCMSC-CM处理BEL-7402细胞24 h后,UCMSC-CM组侵袭细胞数[(228.00±17.91)个]低于对照组[(491.00±10.34)个],差异有统计学意义(P<0.05)。Western blot检测结果显示,对照组与UCMSC-CM组肝癌细胞凋亡相关信号分子GSK-3β、p-GSK-3β、Bak、Bax、BCL-XL、MCL-1及存活素蛋白表达比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。RT-qPCR结果显示,UCMSC-CM处理的HepG2、BEL-7402细胞E-钙黏蛋白的mRNA表达水平[(0.18±0.06)、(0.48±0.25)]较对照组[(1.33±0.06)、(1.01±0.12)]均明显下调(P<0.05)。BEL-7402细胞中snail的mRNA表达水平(3.37±0.41)较对照组(1.01±0.18)明显上调(P<0.05),而HepG2细胞中N-钙黏蛋白、snail和波形蛋白的mRNA表达水平均无明显变化(P>0.05)。结论UCMSC-CM可能通过EMT过程促进肝癌细胞的迁移和侵袭能力。