简介:【背景】空心莲子草是一种源于南美洲且正在我国不断传播的外来入侵植物。莲子草假隔链格孢是空心莲子草的强致病菌,能引起空心莲子草茎叶发病,抑制空心莲子草生长。【方法】选择以麦麸、大米、玉米芯粉、玉米粉、稻秸秆粉为基料,棉籽壳、稻秕壳和大豆粉为辅料,按照一定质量比配制固体培养基,筛选适合莲子草假隔链格孢SF-193大量生产的有效组分;同时研究培养基含水量和6种金属离子对SF-193菌落生长的影响。【结果】在以大米和大豆粉质量比为3:1和5:1的培养基上SF-193菌落面积最大,其次为大米和棉籽壳质量比为5:1的培养基。在含水量为20%和30%的培养基上SF-193菌落面积显著大于其他培养基。Mg2+和Mn2+对SF-193菌落生长影响较小,Zn2+对SF-193菌落生长具有显著的抑制作用,而SF-193菌落在含Cu2+和Fe3+的培养基上不能生长。田间控草试验表明,固体发酵生产的菌粉对空心莲子草的致病性显著高于液体菌,用量为50g.m-2时,10d后空心莲子草的病情指数达86.1。【结论与意义】利用固体培养基发酵生产的莲子草假隔链格孢对空心莲子草的防除效果显著优于液体发酵。因此,莲子草假隔链格孢SF-193固体发酵菌粉可能在生物防治空心莲子草方面具有重要作用。
简介:通过对尖顶羊肚菌液体培养基质与条件的研究,明确其菌丝生长的最适pH值、最适温度、适宜光照条件、适宜葡萄糖和蛋白胨浓度、适宜培养基,以便应用于尖顶羊肚菌液体菌种的生产和工业发酵.结果表明:菌丝的最适生长温度为25℃;最适生长pH值为6;葡萄糖和蛋白胨最适浓度分别为200g/L和10g/L;菌丝在黑暗环境下生长良好,光照对菌丝生长具有抑制作用;用胡萝卜酵母膏培养基振荡培养形成的菌丝球多,菌丝生长量大;菌丝球在不同培养基中生长,可引起培养液pH值的上升或者下降;菌丝球可利用培养基内的氨基酸,使氨基酸降解,在胡萝卜酵母膏培养基中振荡培养8d的菌液总氨基酸含量较原液减少了36.71%,亮氨酸、异亮氨酸和甲硫氨酸含量的下降幅度最大.
简介:摘要目的探讨低氧预处理大鼠脂肪源性间充质干细胞(ADSC)条件培养基对全层皮肤缺损大鼠创面愈合的影响。方法(1)取6周龄雄性SD大鼠1只,颈椎脱臼处死,分离双侧腹股沟脂肪组织,胶原酶消化法提取第3代ADSC,观察细胞形态后用于后续实验。取细胞,采用随机数字表法(分组方法下同)分为成脂诱导组和成骨诱导组,每组各6孔。成脂诱导组培养14 d观察成脂情况,成骨诱导组培养28 d观察成骨情况。(2)取第3代ADSC,分为常氧组和低氧组,常氧组细胞置于氧气体积分数20%的常氧培养箱中培养,低氧组细胞置于氧气体积分数2%的低氧培养箱中培养。常氧组培养3 h,低氧组培养3、6、12、24、48 h,分别取3个样本,进行后续指标检测。实时荧光定量反转录PCR检测低氧诱导因子1α(HIF-1α)、血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)的mRNA表达量。收集2组细胞培养上清液,离心过滤后获得常氧条件培养基(normo-CM)和低氧条件培养基(hypo-CM),酶联免疫吸附测定法检测条件培养基中VEGF、转化生长因子β(TGF-β)、表皮生长因子(EGF)和胰岛素样生长因子(IGF)含量。(3)取27只6~8周龄雄性SD大鼠,分为磷酸盐缓冲液(PBS)组、normo-CM组和hypo-CM组,每组9只,在其背部制作直径为1 cm的圆形全层皮肤缺损创面并分别滴加50 μL PBS、normo-CM及hypo-CM。伤后0、3、5、7、9、11 d,观察创面大体情况,测量创面面积并计算创面未愈合率。取创面组织,苏木精-伊红染色观察伤后3、9、11 d创面炎症反应及伤后9 d创面再上皮化水平;Masson染色观察伤后11 d创面胶原沉积情况,并分析胶原容积分数(CVF)。对数据行重复测量方差分析、单因素方差分析、t检验、Bonferroni校正。结果(1)细胞融合度低时呈长梭形、贴壁生长、排列紧密。培养14 d,成脂诱导组细胞经油红O染色后被染成红色的脂滴。培养28 d,成骨诱导组细胞经茜素红S染色后可见红色结节。细胞鉴定为ADSC。(2)与常氧组比较,低氧组细胞培养12、24 h HIF-1α mRNA表达量明显升高(t=5.43、5.11,P<0.05);培养6、12 h VEGF mRNA表达量明显升高(t=3.29、2.33,P<0.05或P<0.01);bFGF mRNA培养12 h表达量明显升高(t=12.59,P<0.01),培养48 h明显降低(t=9.34,P<0.01);培养3、12、24 h PPAR-γ mRNA明显降低(t=5.14、6.56、4.97,P<0.05)。(3)与常氧组相比,低氧组细胞培养3、6、12、24、48 h VEGF含量明显升高(t=5.74、12.37、14.80、15.70、34.63,P<0.05或P<0.01),培养6、12、24、48 h IGF含量明显升高(t=5.65、8.06、20.12、22.99,P<0.05或P<0.01),培养各时间点TGF-β和EGF含量无明显变化。(4)伤后0~11 d,3组大鼠创面均不同程度缩小,未见明显感染、渗出等。伤后11 d,PBS组大鼠创面面积仍较大;normo-CM组大鼠创面面积较PBS组缩小,hypo-CM组大鼠创面已基本愈合。伤后7 d,normo-CM组和hypo-CM组大鼠创面未愈合率明显低于PBS组(t=10.26、16.03,P<0.05)。伤后9 d,hypo-CM组大鼠创面未愈合率明显低于PBS组和normo-CM组(t=17.25、6.89,P<0.05或P<0.01),normo-CM组大鼠创面未愈合率明显低于PBS组(t=8.81,P<0.05)。伤后11 d,hypo-CM组大鼠创面未愈合率为(2.4±1.5)%,明显低于PBS组的(20.0±5.0)%和normo-CM组的(7.7±1.7)%,t=30.15、84.80,P<0.05。(5)伤后3 d,hypo-CM组大鼠创面炎症细胞浸润明显多于其余2组;伤后9 d,normo-CM组和hypo-CM组大鼠创面炎症细胞浸润均少于PBS组;伤后11 d,hypo-CM组大鼠创面炎症细胞浸润明显少于PBS组和normo-CM组。(6)伤后9 d,hypo-CM组大鼠创面"表皮迁移舌"长度长于其他2组,表皮厚度接近正常皮肤。伤后11 d,与PBS组和normo-CM组相比,hypo-CM组大鼠创面中可见大量结构致密、排列整齐、成熟度较高的胶原沉积。PBS组大鼠创面CVF为(22.90±1.25)%,显著低于normo-CM组的(31.96±0.14)%和hypo-CM组的(56.10±1.50)%(t=12.48、29.43,P<0.05);normo-CM组大鼠创面CVF显著低于hypo-CM组(t=27.73,P<0.05)。结论低氧处理可显著增强大鼠ADSC的旁分泌作用,低氧预处理的大鼠ADSC条件培养基可通过调控炎症细胞浸润程度、促进创面再上皮化和胶原沉积,加速大鼠全层皮肤缺损创面愈合。
简介:摘要目的探讨间充质干细胞条件培养基对多西紫杉醇(Doc)诱导的多倍体肺癌细胞衰老表型的影响。方法人非小细胞肺癌1 299细胞株细胞分为3组,常规组、Doc(24 h)组和Doc(24 h)+3 d组。常规组为二甲基亚砜处理细胞24 h;Doc(24 h)组为100 nmol/L的Doc处理细胞24 h;Doc(24 h)+3 d组为100 nmol/L的Doc处理细胞24 h,更换新鲜的含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基,继续培养3 d。Doc(24 h)+3 d组细胞分为2组,Doc组和Doc+CM组。Doc组为含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中培养4 d;Doc+CM组为含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基和hUC-MSC-CM(1∶1)的混合培养基中培养4 d。Hoechst 33342染色观察细胞核形态,流式细胞术分析细胞DNA含量、线粒体膜电位及DNA损伤应答信号分子磷酸化组蛋白H2A.X(γ-H2A.X)的表达,衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒检测β-半乳糖苷酶活性,实时定量聚合酶链式反应(RTQ-PCR)检测衰老相关的炎性细胞因子白细胞介素6(IL-6)与白细胞介素8(IL-8)的信使核糖核酸(mRNA)表达水平。结果Doc(24 h)组和Doc(24 h)+3 d组细胞核体积增大、DNA含量增加,常规组、Doc(24 h)组和Doc(24 h)+3 d组多倍体细胞百分比分别为(12.27±3.29)%、(27.13±6.02)%和(43.60±4.26)%,Doc(24 h)组和Doc(24 h)+3 d组细胞百分比明显高于常规组,差异有统计学意义(F=33.91,P=0.001)。常规组、Doc(24 h)组与Doc(24 h)+3 d组细胞密度分别为(8.18±0.54)×104/cm2、(3.78±0.54)×104/cm2及(0.75±0.08)×104/cm2,Doc(24 h)组与Doc(24 h)+3 d组细胞密度显著低于常规组,差异有统计学意义(F=212.55,P=0.001)。常规组细胞β-半乳糖苷酶无活性,细胞染色阴性,Doc(24 h)组与Doc(24 h)+3 d组中观察到有呈蓝色的阳性染色细胞,β-半乳糖苷酶活性增强。流式细胞术分析线粒体膜电位,常规组、Doc组与Doc+CM组的JC-1单体百分比分别为(1.7±1.2)%、(48.2±12.9)%及(46.6±12.0)%,Doc组与Doc+CM组低电势细胞百分比明显高于常规组,差异有统计学意义(F=20.15,P=0.002),Doc组细胞与Doc+CM组细胞线粒体膜电位比较,差异无统计学意义(F=20.15,P=0.854)。常规组、Doc组与Doc+CM组中γ-H2A.X表达阳性的细胞百分比分别为(54.9±3.2)%、(58.9±4.0)%及(60.6±5.4)%,差异无统计学意义(F=1.40,P=0.317)。Doc组与Doc+CM组γ-H2A.X荧光信号强度明显高于常规组,荧光信号右移,Doc组与Doc+CM组γ-H2A.X荧光信号强度没有差异,荧光信号没有偏移。Doc组IL-6与IL-8的mRNA表达水平是常规组的(7.22±0.34)倍及(157.64±7.49)倍,差异有统计学意义(t=1.00,P=0.001)。Doc+CM组IL-6与IL-8的mRNA表达水平是Doc组的(48±6)%及(43±3)%,差异有统计学意义( t=1.00,P=0.001)。结论Doc诱导人非小细胞肺癌1 299细胞株细胞产生多倍体肿瘤细胞,即多倍体肺癌细胞,多倍体肺癌细胞表现多种衰老表型特征,hUC-MSC-CM不改变Doc诱导的多倍体肺癌细胞衰老表型,但显著降低了炎性因子IL-6和IL-8的mRNA表达水平。
简介:摘要目的探讨间充质干细胞条件培养基(MSCs-CM)对肺癌多倍体肿瘤巨细胞(PGCC)化学治疗药物敏感性的影响。方法使用1 μmol/L多西他赛处理A549细胞24 h(多西他赛A组),撤除药物后继续在完全培养基中培养至第3天(多西他赛B组),建立肺癌PGCC模型,使用MSCs-CM培养PGCC 48 h(PGCC+MSCs-CM组),以正常培养的A549细胞(A549组)或PGCC(PGCC组)作为对照,流式细胞术检测细胞DNA含量,细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测A549细胞和PGCC对不同浓度多西他赛和顺铂的敏感性以及MSCs-CM对PGCC耐药性的影响,Western blot法检测相关蛋白表达。结果多西他赛B组细胞体积明显增大,细胞核呈多核状态,PGCC亚群(DNA含量>4 N)比例均明显高于DMSO组和多西他赛A组(P<0.05),成功建立肺癌PGCC模型,将多西他赛B组作为PGCC细胞。CCK-8检测结果显示,多西他赛对A549细胞和PGCC的IC50值分别为(0.20±0.04)μmol/L和(11.15±2.47)μmol/L,差异有统计学意义(P<0.05),顺铂对A549细胞和PGCC的IC50值分别为(14.87±3.72)μmol/L和(30.03±4.59)μmol/L,差异有统计学意义(P<0.05),PGCC对多西他赛和顺铂的耐药指数分别为55.75倍和2.02倍。与PGCC组相比,PGCC+MSCs-CM+多西他赛组吸光度值明显下降(P<0.05),且明显低于PGCC+多西他赛组和PGCC+MSCs-CM组(P<0.05)。与PGCC组相比,PGCC+MSCs-CM+顺铂组吸光度值明显下降(P<0.05),且明显低于PGCC+顺铂组和PGCC+MSCs-CM组(P<0.05)。Western blot检测结果显示,与A549组相比,PGCC组自噬微管相关蛋白轻链3A/B(LC3A/B)-Ⅰ/LC3A/B-Ⅱ、B淋巴细胞瘤-2基因(BCL-2)、多药耐药性相关蛋白1(MPR1)表达明显上调(P<0.05),兔抗人选择性自噬接头蛋白1(SQSTM1/P62)、BCL-2相关X蛋白(BAX)表达明显下调(P<0.05);与PGCC组相比,PGCC+MSCs-CM组LC3A/B-Ⅰ/LC3A/B-Ⅱ、BCL-2、MRP1表达明显下调(P<0.05),SQSTM1/P62、BAX表达明显上调(P<0.05),且MRP1表达水平显著低于A549组(P<0.05)。结论肺癌PGCC对化学治疗药物的耐药性明显增强,MSCs-CM可能通过抑制自噬而增加肺癌PGCC对化学治疗药物的敏感性。
简介:摘要目的探讨人脂肪间充质干细胞条件培养基(human adipose-derived mesenchymal stem cells conditioned media,hADSCs-CM)对病理性瘢痕成纤维细胞增殖、迁移能力的影响。方法分离培养hADSCs和病理性瘢痕成纤维细胞,取第3代细胞用于后续实验。于培养12、24、48 h收集hADSCs条件培养基作为实验组条件培养基(12 h-CM、24 h-CM、48 h-CM),无hADSCs的空白无血清低糖DMEM培养基置于培养箱内12、24、48 h作为对照组条件培养基(12 h-CC、24 h-CC、48 h-CC)。选取增生性瘢痕成纤维细胞(HSFs)、瘢痕疙瘩成纤维细胞(KFs)以及正常皮肤成纤维细胞(NFs),分别以实验制备的培养基进行处理,每组培养基3个复孔,以CCK-8实验检测HSFs及KFs的增殖能力,以细胞划痕实验检测条件培养基处理后细胞迁移能力的变化,流式细胞仪分析细胞的周期分布、凋亡及乳酸脱氢酶(LDH)水平变化情况。实验数据以Graphpad 7.0软件进行分析,多组样本均数比较应用One-Way ANOVA,P<0.05为差异有统计学意义。结果CCK-8结果显示,24 h-CM、48 h-CM处理后24 h KFs、HSFs的增殖速度较对照组开始出现明显减慢,HSFs增殖趋势也出现了类似的变化趋势,NFs无明显的增殖趋势变化;实验组条件培养基对HSFs增殖的抑制作用在48 h达到峰值:24 h-CM KFs增殖活性为1.81±0.10,24 h-CC KFs为2.36±0.05(t=4.24,P<0.001);24 h-CM HSFs增殖活性为1.52±0.10,24 h-CC HSFs为1.96±0.15(t=8.98,P=0.001);48 h-CM KFs增殖活性为1.65±0.10,48 h-CC KFs为2.57±0.10(t=26.64,P<0.001);48 h-CM HSFs增殖活性为1.29±0.20,48 h-CC HSFs为1.94±0.10(t=11.14,P<0.001);之后抑制作用渐弱。细胞划痕实验结果表明,与对照组相比,24、48 h收集的hADSCs-CM处理后HSFs和KFs的迁移能力下降。细胞周期检测结果显示,在KFs中,12 h-CM、24 h-CM、48 h-CM组细胞处于G0/G1期的细胞比例较对照组升高,而处于S期的细胞比例则较对照组下降,在HSFs中也观察到了类似的现象。细胞凋亡检测结果显示各组NFs、KFs、HSFs未见明显凋亡。LDH漏出检测结果显示各组间无明显差异。结论hADSCs条件培养基可能通过其中含有的分泌因子抑制病理性瘢痕成纤维细胞的增殖、迁移,但不诱导其凋亡。