地蚕指纹图谱的初步研究

【摘要】  目的建立地蚕药材的反相高效液相色谱（RP-HPLC）指纹图谱研究方法。方法高效液相色谱法，Lichrospher C18柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），乙腈-0.25%磷酸水梯度洗脱,流速1.0 ml/min，检测波长350 nm，柱温35℃。 结果10批药材共标定了25个共有峰。结论利用地蚕RP-HPLC指纹图谱分析方法较全面地反映地蚕药材的内在质量，可用于地蚕药材的质量控制。

【关键词】  地蚕 指纹图谱

地蚕又名肺痨草，为唇形科水苏属植物地蚕Stachys geobombycis C.Y.Wu的全草及地下部分，主产于浙江、江西、福建等地。该药味淡，微甘，性平，归肺、肾经，具有益肾润肺、滋阴补血、清热除烦等功能，用于治疗咳嗽、哮喘等［1］，化学研究［2］报道其有金丝桃苷、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、齐墩果酸等成分。杨中林等［3］以金丝桃苷为对照品高效液相色谱（HPLC）法测定地蚕药材含量。但对地蚕的质量控制方面的研究较少。为了进一步对地蚕药材质量进行科学评价，本实验采用HPLC法对不同产地不同采集时间的地蚕进行指纹图谱的研究，同时进行了系统适应性实验和方法学考察，为地蚕药材的鉴定与质量评价提供依据。

    1  仪器与试药

    1.1  仪器日本岛津LC-20AB高效液相色谱仪( PDA检测器,LC-solution色谱工作站）。

    1.2  试药金丝桃苷对照品(南京青泽医药开发有限公司，含量测定98.48%，批号070415)；地蚕药材经江苏省药品检验所董小平主任药师鉴定；乙腈(色谱纯,山东禹王实业有限公司)；冰醋酸(分析纯，南京化学试剂有限公司)，水（二次重蒸水）经过0.45  μm水系滤膜过滤。

    2  方法与结果

    2.1  色谱条件色谱Lichrospher C18柱(5 μm,4.6 mm×250 mm)，检测波长为350 nm，进样量10 μl，柱温35℃，流速1.0 ml/min，流动相梯度如表1，记录时间为100 min。此条件下对照品金丝桃苷的保留时间18.773 min。

    2.2  供试品溶液的制备  精密称定粉碎后的地蚕样品约5 g，加入75 ml甲醇，回流30 min，滤过，将药液浓缩至干，用少量水溶解，分别用石油醚和醋酸乙酯依次萃取，醋酸乙酯层浓缩至干，甲醇定容于5 ml量瓶中，摇匀，微孔滤膜滤过，即得。表1  流动相梯度

    2.3  对照品溶液的制备  精密称取金丝桃苷对照品1 mg，用甲醇溶解，定容于25 ml量瓶中(浓度为 40 μg/ml)，摇匀即得。

    2.4  方法学考察  取地蚕样品进行指纹图谱预试验，按上述色谱条件，可得到分离度较好、各峰分布较均匀的指纹图谱，并着重选择了地蚕峰面积较大的13个峰，进行方法学考察。

    2.4.1  精密度实验  精密吸取供试品溶液10 μl，按上述色谱条件，连续进样5次，记录色谱图。结果表明，各色谱峰的相对保留时间和其相对峰面积比值基本一致，RSD均小于3.0%，符合指纹图谱色谱技术要求。

    2.4.2  稳定性实验  取同一供试品溶液，按上述色谱条件，分别于0，2，4，8，12，24 h进样检测，记录色谱图。结果表明，各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积比值基本一致，RSD均小于3.0%，说明供试品溶液在24 h内稳定，符合指纹图谱技术要求。

    2.4.3  重复性实验  分别精密称定同一批药物5份，同法制备样品，进样，记录色谱图。结果表明，各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积比值基本一致，RSD均小于3.0%，符合指纹图谱技术要求。

    2.5  指纹图谱及技术参数［4］

    2.5.1  指纹图谱选择及特征峰的标定根据10批供试品HPLC图谱，选择7号供试品作为对照指纹图谱（见图1）。地蚕药材中金丝桃苷为其主要成分，从指纹图谱中可以看出金丝桃苷色谱峰（保留时间RT≌18.833 min，峰面积百分比A%≌20.05%）积分面积最大，作为参照峰，同时得到各批次地蚕药材25个共有峰。图1  地蚕药材的对照指纹图谱

    2.5.2  地蚕指纹图谱相似度计算  按上述实验方法检测10批地蚕药材的指纹图谱（见图2），应用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(A版，国家药典委员会)计算10批药材的相似度，结果分别为：0.980，0.925，0.945，0.972，0.986，0.978，1.000，0.991，0.968，0.967。

    图2  10批地蚕药材的指纹图谱

    2.5.3  共有峰相对保留时间及相对峰面积的比较 参照《中药注射液指纹图谱研究的技术要求(暂行)》［4］，对地蚕药材进行HPLC色谱指纹图谱测定分析，以参照物金丝桃苷(2号峰)的保留时间和峰面积为1，计算10批指纹图谱中25个共有峰的相对保留时间及相对峰峰面积。见表2～3。 表2  10批供试品共有特征指纹峰相对保留时间

    3  讨论 

    3.1  样品来源  10批地蚕药材均源于唇形科植物地蚕Stachys geobombycis C.Y.Wu全草；产地1～4批药材产自浙江省平阳县，5～8批药材产自浙江省雁荡山，9、10批药材产自江苏省徐州市。

    3.2  色谱条件的考察［5］  考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-水-磷酸、甲醇-水-冰醋酸、乙腈-水-磷酸、乙腈-水-冰醋酸多种流动相系统，其中乙腈-水-冰醋酸系统色谱峰分离度好，故选用。乙腈-水-冰醋酸系统中又考察了0.1%，0.5%，0.25%3种冰醋酸浓度，发现冰醋酸浓度为0.25%时色谱峰分离度最好，故选用。根据二级管阵列检测器检测结果，大部分成分在280 nm和350 nm时吸收值大，但280 nm下干扰强，基线不平稳；350 nm下各色谱峰分离好、基线平稳，故采用350 nm为检测波长。本实验曾采用等度洗脱，由于成分复杂，时间过长，改用梯度洗脱，同时保证大部分色谱峰都能在100 min内出峰。 表3  10批供试品共有特征指纹峰峰面积

    3.3  样品制备条件的考察  考察了无水乙醇、95%乙醇、甲醇、75%甲醇、50%甲醇等5种提取溶剂，以色谱峰数量、面积、分离度各因素综合考察，无水乙醇作提取溶剂的样品峰个数最少，其他溶剂提取效果相近，但经放置后发现除甲醇作提取溶剂的样品之外，其他样品均有不同程度的沉淀，最后选用甲醇作提取溶剂。然后考察了超声、回流及索氏提取3种方法，各样品色谱图基本一致，但回流法提取的样品峰面积最大，故采用回流法。接着分别考察了回流30 min，1 h，1.5 h对样品色谱峰的影响，结果各样品色谱图一致，考虑节省能源选用回流30 min。

    采用甲醇热回流提取后，需分别用石油醚和醋酸乙酯萃取，除去极性较大和极性较小的成分，富集黄酮类化合物。

    3.4  参照物的确定  由于地蚕药材黄酮类成分的报道有金丝桃苷、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素，实验发现金丝桃苷含量较高，且该色谱峰分离度好，故选用金丝桃苷。

    3.5   不同产地药材指纹图谱相似度评价10批不同产地地蚕药材样品的指纹图谱基本一致，因此选择7号样品的指纹图谱作为对照指纹图谱，由各批次地蚕药材指纹图谱与对照指纹图谱相似度计算结果可见，10批样品指纹图谱相似度良好（r>0.90）,反应药材的同源性。本方法稳定、可靠、重复性好，可为地蚕原药材及其制剂质量标准的拟定提供依据。

【参考文献】
  ［1］ 《中药辞海》编审委员会.中药辞海［M］.北京：中国医药科技出版社，1993：1948.

［2］ 张中朋，杨中林，唐登峰，等.地蚕化学成分的分离与鉴定［J］.中成药，2004，26（12）：1051.

［3］ Yang ZL,Tang DF,Cheng QH,et al.The compared study of Hyeroside in the aerial part and its rehizome of stachys geobombycis C.Y.Wu var.geobombycis［J］.ITCM，2003，20(4)：24.

［4］ 周玉新，雷海明，徐永红，等.中药指纹图谱研究技术［M］.北京：化学工业出版社，2002：131.

［5］ 国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2005：22.