不同来源金黄色葡萄球菌肠毒素基因分布及多样性研究

不同来源金黄色葡萄球菌肠毒素基因分布及多样性研究

周丽萍王艳巢国祥（通讯作者）

（扬州市疾病预防控制中心江苏扬州225002）

【摘要】葡萄球菌肠毒素是导致葡萄球菌食物中毒的主要原因。本文中对491来源临床、动物、食品及环境用具金黄色葡萄球菌菌株，通过PCR方法检测18种不同的编码肠毒素及类肠毒素的基因(sea、seb、sec、sed、see、seg、seh、sei、selj、selk、sell、selm、seln、selo、selp、selq、ser及selu)。结果表明基因sea、seg、selo、selm、selq、seb、selk、sell检出率相对较高，经典肠毒素基因sea、seb、sec、sed、see及egc基因簇seg、sei、selm、seln、selo和selu的基因分别占所有基因数的25.55%和45.48%。出现三种不同的重要基因簇，即egc基因簇，sea-sek-seq基因簇，及sed-sej-ser基因簇。经典肠毒素基因主要存在于人源及食源性菌株中，egc基因簇基因多数存在于动物株性菌株中。动物株性菌株是新型肠毒素或类肠毒素主要来源，成为新的食品安全隐患。

【关键词】金黄色葡萄球菌；葡萄球菌肠毒素；食物中毒；基因簇

【中图分类号】R595【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2016）36-0081-03

ThepersityofgenesencodingdifferentstaphylococcalenterotoxinsandStaphylococcalenterotoxin-liketoxinsfromStaphylococcusaureusofdifferentsources

ZhouLiping,WangYan,ChaoGuoxiang,YangzhouCenterforDiseaseControlandPrevention,Yangzhou,China225002,China

【Abstract】Staphylococcalenterotoxinsaretheimprotantfactorscausingstaphylococcalfoodbornepoisonings.Inthepresentstudy,wetestedthe18kindsofgenes(sea,seb,sec,sed,see,seg,seh,sei,selj,selk,sell,selm,seln,selo,selp,selq,ser,andselu)encodingthesaphylococcalenterotoxins(SEs)orstaphylococcalenterotoxin-liketoxins(SEls)withPCRamong491Staphylococcusaureusisolatesfromdifferentsources.Resultsshowthatsea,seg,selo,selm,selq,seb,selk,sellwerehigherthanthatoftheothergenes.TheclassicSEgenes,sea,seb,sec,sed,andseeandtheegcgeneclustersseg,sei,selm,seln,selo,andseluaccountedfor25.55%and45.48%,resceptively.Therewerethreegeneclusters,egc,sea-sek-seq,andsed-sej-ser.TheclassicSEgenesoccuredintheisolatesfromhumanandfoodfrequently,whileegcclustersoccuredtheisolatesofanimalsfrequently.TheisolatesfromanimalsweremainsourcesofthenewSEsandSEls,whichbecamethenewpoteneialhazardsforfoodsafety.

【Keywords】Staphylococcusaureus;Staphylococcalenterotoxin;Staphylococcalfoodbornepoisoning;Enterotoxingenecluster

金黄色葡萄球菌是常见的人兽共患病病原菌，产生的葡萄球菌肠毒素(Staphylococcalenterotoxins，SEs)是导致食物中毒的主要原因。迄今为止，已发现19种编码葡萄球菌肠毒素或类肠毒素(Staphylococcalenterotoxin-liketoxins，SEls)相关基因[1,2]。一些肠毒素基因位于移动基因元件如前噬菌体、质粒、转座子，毒力岛等，如seg,sei,sem,sen,andseo(egc基因簇)位于毒力岛vSaβ,而sed,sej,ser位于质粒pIB485[2,3]。葡萄球菌肠毒素有较强的活性，几微克即可导致葡萄球菌食物中毒(staphylococcalfoodbornepoisoning，SFP),导致严重的胃肠道症状如腹泻、呕吐甚至休克等临床症状[4]。葡萄球菌肠毒素包括经典肠毒素SEA、SEB、SEC、SED、SEE，以及新型肠毒素SEG、SEH、SEI、SER、SES和SET。类葡萄球菌肠毒素包括SElJ,SElK,SElL,SElM,SElN,SElO,SElP,SElQ,SElU,SElV和SElX[1,2]。除经典肠毒素外，新型肠毒素如SEG,SEH,SEI和SER在动物试验模型中显示可产生催吐作用导致肠道腹泻症状[5,6,7，8]。一些编码经典肠毒素与类肠毒素的基因在结构上显示非常紧密的线形关系，如sea与selk及selq经常共同出现于同一菌体内形成基因簇sea-sek-seq；seg,seln,sei,selm,selo或基因簇seg,seln,sei,selm,selo,selu形成egc基因簇[2]。

本文通过对不同来源的491株金黄色葡萄球菌进行编码经典肠毒素基因(sea、seb、sec、sed、see)、新型肠毒素基因(seg、seh、sei、ser、ses、set)及类肠毒素基因(selj、selk、sell、selm、seln、selo、selp、selq及selu)检测，分析各类基因及基因簇在不同来源的菌株中的分布情况，为控制肠毒素、新型肠毒毒素以及类肠毒素产生提供参考。

1.材料与方法

1.1菌株来源

在2010至2015年间，我们收集来源于人、动物、环境等来源的金黄色葡萄球菌菌株共491株。306株来源于二家三级甲等医院及一所综合医院，7株来源于公共场所理发工具，102株来源于大型超市及农贸市场采集的食品及生奶。另有76株来源于动物包括猪、鸡、狗等。所有菌株均按照GB4789.10-2010方法进行确认为金黄色葡萄球菌。

1.2基因模板提取

用细菌DNA提取试验盒(TIANampBacgteriaDNAKit,TIANGEN公司，北京)按供应商说明书进行DNA提取。

1.3PCR方法测定肠毒素基因

对18种肠毒素或类肠毒素基因(sea、seb、sec、sed、see、seg、seh、sei、selj、selk、sell、selm、seln、selo、selp、selq、ser及selu)按照Varshney等发表的方法进行PCR分析[3]。扩增产物经测序分析确认以确保扩增结果的特异性。

2.结果

在所491株菌株中，58.62%的菌株携带有一个或多个肠毒素或类肠毒素基因，基因sea、seg、selo、selm、selq、seb、selk、sell相对较高，分别为19.96%、19.76%、18.94%、13.65%、13.44%、11.41%、11.20%、10.18%；最少检测到的基因为sec、selj、ser。属于经典肠毒素基因sea、seb、sec、sed、see及egc基因簇seg、sei、selm、seln、selo和selu的基因分别占所有基因数的25.55%和45.48%。在egc基因簇上的基因以及与该基因簇共同存在的基因(如sea、seb、sell和sea-sek-seq等)占所有基因数的61.68%。4株菌株携带完整的egc基因簇(seg、sei、selm、seln、selo、selu)，而另有50株菌株携带有4～5个egc基因的部分基因簇；而有31株菌株携带有sea、sek、seq的连续基因簇；9株菌株携带sed、selj,ser连续基因簇。

医源性菌株中，54.21%菌株携带有1个以上的肠毒素或类肠毒素基因；26.68%菌株携带有经典基因sea,seb,sec,sed,see，而42.83%携带有egc基因簇的基因。动物源菌株中，有61.86%菌株携带在至少1个肠毒素或类肠毒素基因；未检测到seb、sec、sed、selj、selp和ser基因；经典肠毒素及egc基因簇的基因分别占7.75%和74.89%。在7株来源于公共场所用具的菌株中，未检测到肠毒素或类肠毒素基因。而102中食源株(包括来源于生奶中的菌株)中，71.24%拥有1个以上的基因；经典肠毒素基因及egc基因簇的基因分别占34.11%和34.86%(表1)。

3.讨论

有报道99%医源性菌株携带至少1个肠毒素基因[3]；另有报告94%乳房炎奶牛分离的菌株携带有1个以上的肠毒素基因[9]。这类结果都远远高于本研究肠毒素基因携带结果。本研究中，我们检测18种肠毒素或类肠毒素基因，从人源、动物源及食源的菌株中发现了不同的基因携带模式。结果表明不同来源的菌株携带有不同的肠毒素基因簇。而常见的肠毒素基因为sea、seb、seg、selk、sell、selm、selo及seq。

值得关注的是，三种来源菌株中肠毒素或类肠毒素基因种类多且不同来源携带状况也不一样。食源性菌株的肠毒素基因的携带率高于人源菌株(χ2=9.69,P<0.05)，也高于动物性来源的菌株(χ2=8.31,P<0.05)，人源与动物源菌株肠毒素基因携带率没有显著差异(χ2=0.55,P>0.05)；食源性菌株携带的经典肠毒素基因显著高于人源(χ2=13.03,P<0.01)及动物性菌株(χ2=35.53,P<0.01)，人源性菌株携带情况显著高于动物源性菌株(χ2=16.69,P<0.01)；这些结果似乎表明，除了从人源与动物性菌株，食源株还有其它行径获得相关基因。egc基因簇基因seg、selm、selo,以及selq、selk、sell多数出现在动物源性菌株中，且egc基因簇基因在人源、食源性菌株中无显著差异(χ2=0.16,P>0.05)，但动物源中该基因簇基因却远远高于人源株(χ2=18.59,P<0.01)及食源株(χ2=9.97,P<0.01),表明动物可能是此类基因的主要来源。有研究表明携带有新型肠毒素及类肠毒素的基因的菌株会产生相应的肠毒素并导致了食物中毒事件[10]。所以这类菌株，尤其是动物源性的菌株可能是潜在的新的食品安全威胁。

本文中检出了三种不同的基因簇，即egc基因簇，sea-sek-seq基因簇，及sed-sej-ser基因簇。这些基因簇常常与其它基因或基因簇共同存在。有研究表明1个egc基因的出现往往表示所有的egc簇基因的出现，不仅如此，以egc簇为基础，通过基因交换及再生成，形成新的基因复合体[11,12]。本文中，完整的egc簇仅在少数菌株中出现，多数菌株则携带不完全的egc基因簇。同时还发现，egc基因簇与其它基因或基因簇同时出现，如与sea,seb,sec,sek,seq等，这进一步证明egc基因位点(locus)可能肠毒素基因生成的主要来源[8,11]。本文还出现另一个重要的肠毒素基因簇sea-sek-seq,我们早前研究结果表明该基因簇是与医源性MRSA-Ⅲ有关[15]。基因簇sed-selj-ser检出较少可能在本地区还未流行。

4.结论

本文中，最常出现的肠毒素或类肠毒素基因为sea、seb、seg、selk、sell、selm、selo和seq。菌株来源不同，则肠毒素基因分布谱也不一样。出现了三种重要的肠毒素基因簇：egc基因簇，sea-sek-seq基因簇，以及sed-sej-ser基因簇。egc基因簇是最重要的基因簇，它是新的基因簇或复合体的来源。人源及食源性菌株主要携带经典肠毒素基因，而动物株性菌株主要携带egc基因簇基因。人源及食源的菌株是经典食物中毒菌株的主要来源，而动物株性菌株则是新型肠毒素或类肠毒素可能来源，成为新的食品安全隐患。

【参考文献】

[1]ChaoGX,BaoGY,JiaoXA,2014.MolecularepidemiologicalcharacteristicsandclonalgeneticpersityofStaphylococcusaureuswithdifferentoriginsinChina.FoodbornePathog.Dis.7,503-510.

[2]ArgudínMA,MendozaMC,RodicioMR.FoodpoisoningandStaphylococcusaureusenterotoxins.Toxins2,2010;1751-1773.

[3]VarshneyAK,MediavillaJR,RobiouN,etal.perseEnterotoxinGeneProfilesamongClonalComplexesofStaphylococcusaureusIsolatesfromtheBronx,NewYork.ApplEnvironMicrobiol2009;75:6839-6849.

[4]LeLoirY,BaronF,GautierM.Staphylococcusaureusandfoodpoisoning.GenetMolRes2003;2:63-76.

[5]HwangSY,KimSH,JangEJ,etal.NovelmultiplexPCRforthedetectionoftheStaphylococcusaureussuperantigenanditsapplicationtorawmeatisolatesinKorea.IntJFoodMicrobiol2007;117:99-105.

[6]ShuppJW,JettM,PontzerCH.IdentificationofatranscytosisepitopeonStaphylococcalenterotoxins.InfectImmun2002;70:2178-2186.

[7]ThomasDY,JarraudS,LemercierB,etal.Staphylocccalenterotoxin-liketoxinsU2andV,twonewstaphylococcalsuperantigensarisingfromrecombinationwithintheenterotoxingenecluster.InfectImmun2006;74:4724-4734.

[8]OmoeK,IshikawaM,ShimodaY,etal.Detectionofseg,seh,andseigenesinStaphylococcusaureusisolatesanddeterminationoftheenterotoxinproductivitiesofS.aureusisolatesharboringseg,seh,orseigenes.JClinMicrobiol2002;40:857-862.

[9]SrinivasanV,AshishAS,BarbaraEG,SusanJH,LorenzaC,StephenPO,2006.PrevalenceofEnterotoxinandToxicShockSyndromeToxinGenesinStaphylococcusaureusIsolatedfromMilkofCowswithMastitis.FoodbornePathog.Dis.3,284-283.

[10]McLauchlinJ,NarayananGL,MithaniV,etal.ThedetectionofenterotoxinsandtoxicshocksyndrometoxingenesinStaphylococcusaureusbypolymerasechainreaction.JFoodProt2000;63:479-488.

[11]JarraudS,PeyratMA,LimA,etal.egc,ahighlyprevalentoperonofenterotoxingene,formsaputativenurseryofsuperantigensinStaphylococcusaureus.JImmunol2001;166:669-677.

[12]ThomasD,ChouS,DauwalderO,etal.persityinStaphylococcusaureusenterotoxins.ChemImmunolAllergy2007;93:24-41.

[13]CremonesiP,LuzzanaM,BrascaM,MorandiS,LodiR,etal.DevelopmentofamultiplexPCRassayfortheidentificationofStaphylococcusaureusenterotoxigenicstrainsisolatedfrommilkanddairyproducts.MolCellProbes2005;19:299-305.

[14]RosecJ,andOGigaud.StaphylococcalenterotoxingenesofclassicalandnewtypesdetectedbyPCRinFrance.IntJFoodMicrobiol2002;77:61-70.

[15]ChaoGX,BaoGY,YanWG,WangY,ZhangXR,ZhouLP,WuYT.PrevalenceandpersityofenterotoxingeneswithgeneticbackgroundofStaphylococcusaureusstrainsfromdifferentoriginsinChina.InternationalJournalofFoodMicrobiology2015,211:142-147.

基金项目：扬州市自然科学基金(YZ2014060)