四川省绵阳市某地持续发现HIV感染者基因亲缘性分析

四川省绵阳市某地持续发现HIV感染者基因亲缘性分析

李川 杨红 罗成瑞周良君 陈果

绵阳市疾病预防控制中心，四川 621000

基金项目：2022年四川省艾滋病防治社会动员项目绵阳子云小组中老年男性干预项目 2022省-B12

摘要：目的 通过分析绵阳市某地14例HIV（human immunodeficiency virus）阳性感染者病例分子传播网络特征，为确定HIV-1感染事件的传染源和传播链条提供实验室依据，为进一步开展艾滋病防治提供参考。方法 对14例HIV阳性病例进行确证、核酸提取、核酸扩增、测序和分型，采用巢式RT-PCR扩增HIV-1 pol基因片段，利用进化分析和分子网络分析方法对DNA序列进行分析。结果对14条序列进行分子网络分析，共检出3种基因亚型CRFs，分别是01_AE（3，21.4%）、07_BC（9，64.2%）、08_BC（2，14.2%）。当基因阈值为0.9%时，14条序列被分成三簇，最后利用 HIV-Trace生成可视化网络，形成存在潜在联系的分子簇，显示相同亚型的毒株都形成了同一个分子簇。结论 该地区HIV感染者来源多元化，相同基因亚型病例间存在分子网络传播特征，≧55岁中老年人群应加强动态监测和长期干预，文化程度低的中老人群也应重点关注其身心健康，及早采取措施，防止HIV感染，避免了艾滋病病毒的进一步蔓延。

关键词：基因测序；进化分析；艾滋；分子流行病学；分子簇；核酸；基因亚型；毒株

Analysis of genetic consanguinity of HIV-infected patients with continuous discovery in Mianyang City, Sichuan Province

LI Chuan,YANG Hong,LUO cheng-rui,ZHOU Liang-jun,CHEN guo

Mianyang City Center for Disease Control and Prevention,Sichuan621000,China

Fund projects:2022 Sichuan Province AIDS Prevention and control social mobilization project Mianyang Ziyun Group intervention project for middle-aged and elderly men  2022 province-B12

Abstract: Objective By analyzing the molecular transmission network characteristics of 14 HIV ( human immunodeficiency virus ) positive cases in Mianyang City, this paper provides a laboratory basis for determining the source of infection and transmission chain of HIV-1 infection events, and provides a reference for further AIDS prevention and control. Methods Fourteen HIV-positive cases were confirmed, nucleic acid extracted, nucleic acid amplified, sequenced and typed. HIV-1 pol gene fragment was amplified by nested RT-PCR, and the DNA sequence was analyzed by evolutionary analysis and molecular network analysis. Results The molecular network analysis of 14 sequences showed that 3 subtypes of CRFs were detected, which were 01 _ AE ( 3,21.4 % ), 07 _ BC ( 9,64.2 % ) and 08 _ BC ( 2,14.2 % ). When the gene threshold was 0.9 %, the 14 sequences were pided into three clusters. Finally, HIV-Trace was used to generate a visual network to form a molecular cluster with potential connections, indicating that strains of the same subtype formed the same molecular cluster.

Conclusion The source of HIV infection in this area is persified, and there are molecular network transmission characteristics among the cases of the same gene subtype. The middle-aged and elderly people aged ≧55 years old should strengthen dynamic monitoring and long-term intervention. The middle-aged and elderly people with low education level should also focus on their physical and mental health, take early measures to prevent HIV infection and avoid the further spread of HIV.

Key words:Gene sequencing; Evolutionary analysis; AIDS; Molecular epidemiology; Molecular cluster ; Nucleic acid; Gene subtype; Virus strain

HIV为单链RNA病毒，病毒结构简单，但在病毒复制过程中存在高突变率、高错误率和免疫逃逸机制，导致HIV具有高度的变异性。由于基因复制过程中的相似性，在同一传播链上的两个个体中HIV毒株的基因序列的相似性会高于非传染关系中的毒株，因此，通过分析基因序列间的关系可以推断出感染者HIV之间的亲缘关系。利用基因测序结果对感染的毒株进行同源性分析，从病原分子角度精准构建HIV感染者之间的相互传播链条，可及时切断传播链，及时针对性的开展干预，从而为健康人群保护提供依据，根据溯源情况进行流行病学调查，进一步查找传染源，进一步切断传播途径。近年来，HIV分子传播网络分析逐步应用于揭示HIV感染者传播关系以及传播规律，对艾滋病的传播动态进行实时掌控， 为艾滋病精准干预提供了科学有效的指导。本文对对某地14例病例进行确证、核酸提取、核酸扩增、测序和分型，采用进化分析和分子网络分析方法，结果分析如下：

1 材料与方法

1.1样本来源 

绵阳市某地筛查阳性样本复核样血浆标本且本实验室确证为阳性的标本。

1.2 实验方法

1.2.1 核酸提取

使用罗氏MagNA Pure96自动核酸提取仪MagNAPure96罗氏公司核酸提取试剂盒提取RNA，具体步骤按照相关仪器操作规程。

1.2.2 核酸扩增和测序

使用TaKaRa One Step RNA PCR Kit (AMV)酶试剂盒进行扩增HIV基因序列，并对PCR产物进行纯化处理，In-house测序法进行测序，测序分析由北京德弘昌远生物科技有限公司完成。

1.2.3 进化分析方法 

从LANL数据库中随机挑选01_AE、07_BC、08_BC参考株基因组序列各5条作为参考株序列与14条序列合并后用于进化分析，采用muscle进行序列比对，然后利用Gblocks（Version 0.91b，http://molevol.cmima.csic.es/castresana/Gblocks_server.html，参数设置-t=d， -b4=5 ，-b5=h， -z=v）从多序列比对结果中提取出保守位点序列，以利于下一步的进化分析。在构建系统发育树之前，首先通过jModelTest选择最优模型（GTR + Gamma），然后采用PhyML软件构建序列间最大似然系统发育树，并用Figtree软件进行树形图显示。

1.2.4分子网络分析方法 

以 HXB2_pro/RT 区作为参考序列，利用bealign进行序列比对，然后使用TN93模型计算成对基因距离。在计算分子网络时，当基因阈值为0.009时，14条序列都已成簇，并且被分成三簇，所以选择基因阈值为0.009构建分子网络。最后利用 HIV-Trace生成可视化网络，形成存在潜在联系的分子簇。

2.结果

2.1 基本情况

14例艾滋阳性感染者中，男性12人，女性2人,男女比例为6：1；年龄均55岁及以上，为中老年人群体，其中老年人群体占比高达78.58%。现住址集中在镇2，其中镇2有12例，镇1有2例。在婚姻状况方面，已婚有配偶8人，离异或丧偶6人（43%）。文化程度方面，文盲有7人，占比50%，仅有1人文化程度为初中。确证时间上，有1人在2021年确证，其余均在2022年确证。见表1。

表1 14例艾滋阳性感染者病例基本情况

2.2 亚型分布

在获得pol区序列的14例艾滋感染者中，共检出3种基因亚型CRFs，分别是01_AE (3例，21.4%)、07_BC（9例，64.3%）、 08_BC（2例，14.3%），见表2。

表2  14例艾滋阳性感染者基因型检测情况

2.3进化分析方法  

进化分析结果显示，共发现3个传播簇。其中相同颜色的分支代表的毒株序列属于同一亚型，蓝色是08_BC亚型，橙色是07_BC亚型，绿色是01_AE亚型，红色是HXB2参考株。其中07_BC亚型的分支里面存在着不同程度的变异，表现出不同的亚支分型。见图1。

图1系统发育树

2.4分子网络分析方法

对14条序列进行分子网络分析，结果显示相同亚型的毒株都形成了同一个分子簇，共出现3个分子簇，分别是01_AE、07_BC、08_BC，其中07_BC分子簇最大。见图2。

图2 分子网络图

3.讨论

本研究通过分子流行病学的分析方法来推断该14例患者 HIV-1 的感染来源。有相关研究［1］证明 pol 区基因比 env区和 gag区基因更为保守，包含丰富的进化信息， 可使用该片段序列追踪感染时间比较长的传播信息，因此本研究选取pol区基因进行测序分析。通过分析两个样本之间的基因同源性并构建系统进化树，并且在进化树上形成了以01_AE、07_BC、08_BC三个独立的进化簇，说明相同亚型之间存在明显的进化关系，且差异性越小进化关系越近［2］。

本实验室在确证实验过程中，发现某地2022年4-6月密集出现大量老年男性艾滋感染者，遂根据老年人的感染情况将某镇1 2021年感染者病例1同2022年某地4-6月份新发现的艾滋感染者病例2-14，一并进行测序。测序结果显示病例1和病例5、病例12存在高度同源性，时间跨度近一年，很可能病例1感染艾滋后继续长时间从事低挡暗娼行为；本研究中，基因亚型07_BC病例有9例，其中女性1人，男性8人，也提示存在聚集性暗娼的可能，低档暗娼人群由于知识层面的局限性， 中国低档暗娼人群艾滋病防治知识知晓率较低［3］， 其自我保护意识较差， 为了躲避公安等的打击， 她们的流动性往往非常大， 传播艾滋病的可能性也更大［4］。

本研究中，感染者年龄均>=55岁老年人，文盲50%,丧偶或离异占比43%，均是农村人口，提示老年人群传播风险高［5］，有研究显示农村地区 40 岁以上单身男性感染 HIV 的影响因素为艾滋病相关知识缺乏和不安全性行为且相对女性感染占比大［6］且受收入低影响， 农民多选择更加隐蔽、 方便的低档商业性性服务场所［7］。随着老龄化社会的发展， 老年男性艾滋病病毒感染者人数迅速增加， 是我国艾滋病疫情的一个新特点［8］。2020 年新报告的艾滋病病毒感染者及病人中，老年人群占比最高达 60%以上［9］， 多为异性传播感染［10］。在全球老龄化背景下，我国老龄化形势更加严峻。我国老年人口数目庞大， 预计在2025年超过4.87亿［11］。老年人由于防艾知识的缺乏以及寿命的延长对生活各方面的追求增加，老年患者增长非常明显。2017年，我国开始将老年人，尤其是男性， 放入到防控的重点人群中［12］，老年人由于免于功能低下，身体机能随着年龄的增长逐渐减退,感染后症状更加严重，其生命的长度与感染时的年龄成反比，生活质量极其低下［13］。近年来，我国 HIV 传播的重要人群当中，50岁及以上老年人群和 MSM 的 HIV 感染人数每年成上升趋势，形势日趋严重［14］。

综上所述，分子流行病学调查的方法可以弥补现场流行病学的不足， 对一些不明原因传播等信息进行补充和证明，可以从微观阐明病毒的传播链，找到传染源，从而为艾滋病的防控提供更精准的证据，发现潜在的防控漏洞。本研究对14例艾滋病感染者进行 pol 区基因测序，利用分子传播网络分析方法揭示HIV 毒株亚型分布现状以及分子网络特征，结合流行病学调查，并及时开展干预，避免了艾滋病病毒的进一步蔓延，该传播链疫情传播得到有效遏制，社会效益与经济效益显著，积极响应了《2021-2026 全球艾滋病防治战略》，进一步把艾滋病防控工作做深做细，最终推进2030全球终结艾滋病的目标的实现，同时我们也应该认识到关爱老年人身心健康刻不容缓。

参考文献：

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作者简介及联系方式

李川（1991-），男，主管技师，主要从事HIV等病毒的检测工作。

通讯地址：绵阳市高新区绵兴东路50号 621000

E-mail：941068520@qq.com  联系电话：18782984201基金项目：2022年四川省艾滋病防治社会动员项目绵阳子云小组中老年男性干预项目 2022省-B12