简介：背景：研究表明GEF-H1能激活Rho蛋白，与肿瘤发生、发展、浸润、迁移等密切相关。目的：构建人pEGFP-GEF-H1载体并稳定转染结肠癌HCT116细胞后检测GEF-H1表达。方法：在线合成引物软件设计人GEF-H1基因引物，构建重组质粒pEGFP-GEF-H1，并转染结肠癌HCT116细胞，以转染空质粒和未转染的细胞分别作为空质粒组和空白对照组。荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达，RT-PCR和蛋白质印迹法分别检测GEF-H1mRNA和蛋白表达水平。结果：成功构建了人pEGFP-GEF-H1载体，测序结果表明序列正确。转染重组质粒pEGFP-GEF-H1后，荧光显微镜下可见较强的绿色荧光，GEF-H1mRNA和蛋白表达水平均较空质粒组和空白对照组明显上调。结论：体外成功构建了人pEGFP-GEF-H1载体，且转染结肠癌HCT116细胞后高表达GEF-H1，为进一步探讨结肠癌与GEF-H1的关系提供了必要的实验材料。

简介：目的构建HCV感染相关干扰素IFNL4蛋白融合His标签的真核表达载体,并将其在293-T细胞中表达后进行初步纯化鉴定。方法采用PCR法从含人IFNL4基因序列的质粒pFC14A-p179中扩增出目的片段,将其定向连接到pcDNA3.1-His真核表达载体中,经酶切和测序鉴定正确后,以脂质体法转染293-T细胞,培养72h后裂解细胞,采用抗His-Tag抗体行蛋白质印迹法检测目的蛋白的表达。结果成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-IFNL4-His,转染后经Westernblot法检测显示20kDa位置有目的蛋白条带,大小与目的蛋白相符。结论我们成功构建了HCV感染相关IFNL4与His标签融合的真核表达载体,体外转染293-T细胞后鉴定其工作良好,为后续对干扰素在HCV感染及抗肝纤维化治疗中的研究奠定了基础。

简介：目的构建表达针对HBsAg小发卡RNA（shRNA）的重组腺相关病毒载体,以观察该病毒在体外对HBsAg和HBeAg的抑制作用。方法将表达针对HBsAg的shRNA定向克隆到pAAV/U6-hrGFP质粒中,获得重组表达质粒（pAAV-shHBs-hrGFP）;采用磷酸钙转染法将该质粒与包装质粒pAAV-RC和辅助质粒pHelper共同转染AAV293细胞,进行rAAV-shHBs-hrGFP重组病毒包装。收获病毒感染HepG2.215细胞;采用ELISA法检测HBsAg和HBeAg水平。结果酶切鉴定、测序结果表明,pAAV-shHBs-hrGFP载体成功构建。包装收获的rAAV-shHBs-hrGFP病毒液可以感染HepG2.215细胞,并且可以抑制HBsAg和HBeAg的表达。结论制备的rAAV-shHBs-hrGFP病毒载体能够抑制HBV在体外的抗原表达。

简介：目的建立c-Met慢病毒载体转染人脐带间充质干细胞（hUMSC）,为治疗肝衰竭作为种子细胞.方法培养hUMSC,经流式细胞技术检测细胞表面表型,转染c-Met慢病毒载体,在荧光显微镜下观察转染效率,确定最佳多重感染复数（MOI）.采用嘌呤霉素抗性筛选稳定表达c-Met的hUMSC细胞系,采用Western-blot法检测细胞c-met蛋白表达量.结果P5代细胞高表达CD44、CD90和CD105抗原,不表达CD31、CD45和CD34相关造血细胞抗原,符合人脐带间充质干细胞的特性;构建成功的c-Met慢病毒载体转染人脐带间充质干细胞最佳MOI=80,经嘌呤霉素筛药,在荧光显微镜下观察发现荧光阳性率为100%,且经Western-blot法检测证实该细胞过表达c-Met蛋白.结论成功构建过表达c-Met基因的脐带间充质干细胞,为进-步实验打下了基础.

简介：

简介：目的：利用乳链菌穿梭载体构建肿瘤特异标记表达系统，为肿瘤特异性口服疫苗的研究开辟一个新领域。方法采用体外基因拼装的方法得到PEG-3启动子，经酶切鉴定并测序验证。然后利用基因克隆技术，将PEG-3启动子、EGFP、PolyA亚克隆到乳链菌载体pTRKH2中，成功得到肿瘤特异标记质粒pTR-peg3-egfp。最后，转染肿瘤及非肿瘤细胞初步验证其肿瘤特异性标记能力。结果通过PCR基因拼装得到460bp左右目的片段，测序结果与设计完全一致。获得了肿瘤特异标记的乳链菌穿梭质粒pTR-peg3-egfp，并在细胞水平得到初步验证。结论PEG-3启动子介导的乳链菌穿梭质粒具有肿瘤特异性，这一实用新颖的系统将为研究乳链菌疫苗应用于肿瘤标记及靶向治疗奠定基础。

简介：病变组织差异表达基因的分析有助于寻找与疾病发生、发展和临床治疗有关的关键分子。目的：应用寡核苷酸芯片对Barrett食管与正常食管黏膜组织的差异表达基因进行高通量分析．以期筛选与Barrett食管发生、发展相关的分子标记物。方法：取6例Barrett食管患者病变食管黏膜和相应正常食管黏膜组织。Trizol一步法抽提总RNA．纯化后合成cRNA探针；探针荧光标记和纯化后，将两种组织探针分别与Agilent全基因组寡核苷酸芯片（含30968个基因组探针）进行杂交；获取芯片扫描图谱，以特征提取软件行定量分析、处理。结果：Barrett食管与正常食管黏膜组织的2倍差异表达（Ratio值≥2或≤0．5）基因中，上调基因142个，下调基因284个，涉及细胞周期相关基因、信号转导相关基因、黏蛋白相关基因、癌基因和抑癌基因、骨形态蛋白基因、凋亡抑制基因、bcl-2家族相关基因等。结论：高通量的基因芯片技术可筛选出大量Barrett食管相关基因，对这些相关基因的功能进行验证将有助于找到Barrett食管发生、发展的关键基因或通路。

简介：幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,Hp)是上消化道疾病的主要致病菌,它的感染不但与B型胃炎和消化性溃疡的发生有密切关系,而且与非溃疡性消化不良,MALT淋巴瘤和胃癌也有重要关系,并已被世界卫生组织列为胃癌等肿瘤的相关致病菌[1,2,3].Hp在我国普通人群的感染率较为高50%～80%[4].随着分子生物学技术的发展,幽门螺杆菌致病机理研究的进一步深入,有效抗原的筛选,以及基因工程菌株构建的运用,将预防和根治Hp的感染成为了可能.因此,本实验以Hp特快特异性基因--18kDa外膜蛋白基因,经PCR扩增,构建重组载体,为在原核生物表达创造条件,同时为疫苗的研究以及快速诊断试剂盒的开发奠定基础.

简介：目的探讨四种肝细胞系Huh7、HepG2、HepG2.2.15和L02天然免疫相关分子的表达情况及HBV对其表达的影响。方法提取Huh7、HepG2、HepG2.2.15和L02四种肝细胞及转染后Huh7、HepG2和HepG2.2.15细胞mRNA,逆转录合成cDNA,采用PCR法检测天然免疫相关分子的表达情况。结果四种细胞均能表达TLRs家族的TLR1、TLR3、TLR4、TLR9,NLRs家族的NOD1和RLRs家族的RIG1等天然免疫相关分子;HepG2和Huh7转染HBV可复制性克隆后出现MDA5和A20的表达下调。结论四种肝细胞系均能表达一系列天然免疫相关分子,不同肝细胞系间表达存在一定的差异。HBV瞬时转染和稳定表达能不同程度地影响这些天然免疫相关分子的表达水平。

简介：目的分析水通道蛋白在便秘小鼠结肠黏膜中的表达。方法通过逆转录聚合酶链反应、WesternBlot法以及免疫组织化学染色法对便秘组和对照组小鼠升结肠、降结肠黏膜中水通道蛋白4、9(AQP4、AQP9)mRNA表达进行检测。结果免疫组化结果显示，两组均分布AQP4、AQP9表达阳性细胞且分别处于结肠近端和结肠远端，便秘组较对照组AQP4表达量明显升髙，AQP9表达量明显降低，差异有统计学意义（P<0.05);Westernblot检查结果分析提示AQP4、AQP9的分子量和内参蛋白分子量分别为28kd、42kd;两组摄食量、摄水量、体重、粪便含水量、小肠推进率、血清指标比较，差异有统计学意义(P<0.05)。相关性分析显示，AQP4表达水平与摄水量、粪便含水量间呈负相关性（rw=-0.791、-0.882，rRT=-0.836、-0.855，P<0.05);而AQP9表达水平与摄水量、粪便含水量成正相关性(rw=0.899、0.953,rRT=0.886、0.934，P<0.05)。结论便秘小鼠结肠黏膜中水通道蛋白表达的上调或下调将会直接影响肠道水分的分泌与吸收，在便秘发生、发展中扮演着重要的角色。

简介：

简介：目的探讨CD147在肝胆管结石并发胆管细胞癌（ICC）组织的表达及其临床意义。方法收集肝胆管结石并发ICC标本30例、对应的癌旁肝组织标本30例和正常肝标本10例。采用qRT-PCR法检测组织CD147mRNA水平,采用免疫组化法检测CD147蛋白的表达;采用Western-Blotting法检测基质金属蛋白酶-2（MMP-2）和9（MMP-9）蛋白的表达;采用肯德尔（Kendall）等级相关分析CD147mRNA、CD147、MMP-2和MMP-9表达的相关性。结果经qRT-PCR检测显示,肝胆管结石并发ICC组织CD147mRNA水平为（3.67±1.88）,显著高于癌旁组织【（1.52±0.57）,P〈0.01】和正常肝组织【（1.05±0.32）,P〈0.01】,癌旁组织高于正常肝组织（P〈0.01）;〉5cmICC组织CD147mRNA相对水平（2.73±0.97）显著高于〈5cm肿瘤组织【（1.03±0.32）,P〈0.01】,有淋巴转移（2.68±0.74）组织显著高于无转移组织【（1.07±0.44）,P〈0.01】,肿瘤分化程度低组织（2.71±0.86）显著高于中高分化组织【（1.06±0.42）,P〈0.01】;不同年龄和性别患者ICC组织CD147mRNA水平无显著性差异（P〉0.05）;经免疫组化检测显示,肝胆管结石并发ICC组织CD147蛋白表达相对水平为（27.95±4.90）,显著高于癌旁组织【（13.34±9.59）,P〈0.01】和正常肝组织【（2.18±0.66）,P〈0.01】,而癌旁组织高于正常肝组织（P〈0.01）;ICC组织MMP2表达量为（1.06±0.13）,显著高于癌旁组织【（0.20±0.03）,P〈0.01】和正常肝组织【（0.15±0.02）,P〈0.01】,而癌旁组织MMP2表达量显著高于正常肝组织（P〈0.01）;肝胆管结石并发ICC组织MMP9表达量为（0.93±0.12）,显著高于癌旁组织【（0.17±0.03）,P〈0.01】和正常肝组织【（0.15±0.03）,P〈0.01】,而癌旁组织MMP9表达量显著高于正常肝组织（P〈0.01）;在ICC组织中,CD147mRNA水平与MMP2蛋白表达呈正相关（r=0.457,P〈0.05）;CD147mRNA水平与MMP9蛋白表达也呈正相关（r=0.428,P〈0.05）;CD147�

简介：目的研究MPP3表达减少与大肠癌发病的关系。方法RT-PCR法检测正常大肠黏膜、大肠腺瘤和大肠癌的MPP3mRNA表达;WesternBlotting法检测正常大肠黏膜、大肠腺瘤和大肠癌的MPP3蛋白表达。结果大肠腺瘤中MPP3表达无明显减少（P〉0.05）,部分大肠癌组织中MPP3表达减少,且有淋巴结转移患者比无淋巴结转移患者更常见（P〈0.05）,DukesC期和D期患者比DukesA期和B期患者更常见（P〈0.05）。结论MPP3表达减少在大肠癌中为常见现象,而且在晚期肿瘤更明显,因此,MPP3在大肠癌发病中可能发挥重要作用。

简介：目的观察端粒酶催化亚基（hTERT）、c-myc在胆囊癌中的表达，探讨hTERT及c-myc与胆囊癌的相关性。方法采用免疫组织化学方法检测15例胆囊癌组织、癌旁组织、正常胆囊黏膜及20例胆囊腺瘤性息肉组织hTERT、c-myc的表达。结果①正常胆囊黏膜、胆囊腺瘤性息肉组织、癌旁组织及胆囊癌组织hTERT的阳性表达率分别为6，67％（1/15）、10．00％（2／20）、33．33％（5／15）及80％（12／15）；c-myc阳性表达率分别为20．00％（3／15）、45．00％（9／20）、40％（6／15）及86．67％（13／15）；胆囊癌组织中hTERT与c-myc阳性表达率明显高于其它组织（P〈0．05）；②胆囊癌组织hTERT和c-myc表达与淋巴结转移有关，伴淋巴结转移的胆囊癌hTERT及c-myc阳性表达率明显高于无淋巴结转移者（P〈0．05）；③c-myc在hTERT阳性的胆囊癌组织的表达率明显高于hTERT阴性组（P〈0．05）。结论hTERT过度表达在胆囊癌的发生发展过程中具有重要作用，c-myc在转录水平上调控hTERT的表达，进而激活端粒酶促进胆囊癌的形成。

简介：背景:直肠类癌属于神经内分泌肿瘤,临床上较少见。目前对直径1~2cm的直肠类癌的治疗方式尚存在争议。目的:检测Ki-67在直肠类癌中的表达水平,探讨直肠类癌内镜切除治疗的疗效和安全性。方法:回顾性收集重庆三峡中心医院和武汉同济医院2008年1月至2013年12月期间确诊为直肠类癌,肿瘤直径<1.5cm、行内镜黏膜切除术的患者83例,分析其病例资料,并以免疫组化方法检测肿瘤组织Ki-67表达。结果:术前内镜超声检查显示83例患者肿瘤均位于黏膜层或黏膜下层,无固有肌层浸润或转移,术后平均随访38个月,无一例患者复发或转移。所有患者肿瘤组织Ki-67均呈低表达(0.84%±0.67%),肿瘤直径<1.0cm与1.0~1.5cm组间性别、年龄、肿瘤部位、Ki-67表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。以Ki-67指数均值0.84%为临界值分组,两组间各项临床病理参数差异亦无统计学意义(P>0.05)。结论:本组直径<1.5cm的直肠类癌Ki-67均呈低表达,提示肿瘤细胞增殖不活跃。对于直径<1.5cm、无固有肌层浸润或转移、Ki-67低表达的直肠类癌,内镜局部切除治疗安全、有效。

简介：背景:在中国恶性肿瘤发病率和死亡率排序中,胃癌分居第二和第三位。探索方法简便、敏感性高的非侵入性指标以筛选出胃癌高危人群接受胃镜检查是胃癌普查的有效途径。目的:探讨三叶因子3(TFF3)作为胃癌筛查血清生物学标记物的临床价值。方法:收集宁波市医疗中心李惠利医院2013年7月—2014年1月49例胃癌患者和29名健康体检者的血清标本,采用ELISA法检测血清TFFs浓度,以ROC曲线及其曲线下面积(AUC)分析血清TFF1、TFF2、TFF3对胃癌的诊断性能,并进一步分析三者与胃癌临床病理特征的关系。结果:胃癌组TFF3血清浓度显著高于健康对照组[(43.57±19.49)ng/mL对(29.97±14.20)ng/mL,P<0.01],两组间TFF1、TFF2血清浓度差异无统计学意义(P>0.05)。血清TFF1、TFF2、TFF3诊断胃癌的AUC分别为0.56、0.56和0.83,TFF3诊断性能最高;以33.0ng/mL为TFF3cutoff值,相应敏感性和特异性分别为63.3%和82.8%,预测胃癌风险的OR值为8.27。TFF3血清浓度与胃癌TNM分期、分化程度和淋巴结转移显著相关(P<0.05)。结论:血清TFF3是一个有应用前景的非侵入性胃癌筛查生物学标记物。

简介：目的探讨MMP-7(基质溶解素)在结直肠上皮病变的恶性转变中的表达及意义。方法用免疫组化方法检测37例结直肠癌，23例结直肠腺瘤、10例非肿瘤性息肉及10例正常结直肠组织手术标本的石蜡切片中MMP-7的表达。结果37例结直肠癌切片中25例MMP-7为阳性表达(阳性表达率67．6％)；23例腺瘤切片中，15例表达阳性，阳性表达率65．2％；10例非肿瘤性息肉中，1例阳性表达，阳性率10％；10例正常结直肠上皮对照均未见表达。结论MMP-7在结直肠上皮病变的恶性变中逐渐增强，在结直肠癌的发生发展中起重要作用。

简介：

简介：1983年发现幽门螺杆菌(Hp)以来,有关Hp在慢性活动性胃炎、慢性萎缩性胃炎和消化性溃疡发病中的作用已引起国内外学者的高度重视,并且认为,Hp是胃腺癌发生的一种Ⅰ类(肯定)致癌物.流行病学资料提示,Hp感染人群胃癌发生危险性显著高于对照人群[1-3].动物实验证实,Hp慢性感染易引起胃粘膜组织恶性转化[4-5],但其致癌机制尚不清楚.

简介：目的探讨胃癌病人外周血中CK20mRNA的：表达及临床意义。方法采用巢式RT-PCR技术检测70例胃癌病人手术前、后外周血CK20mRNA的表达情况，并以20例健康志愿者为阴性对照，以胃腺癌细胞株BGC-823作阳性对照。结果CK20mRNA术前阳性表达率为32．9％，阳性表达率与组织学类型具有相关性（P〈0．01），而与TNM分期、肿瘤的部位、病人性别无明显相关性（P〉0．05）。术后CK20mRNA阳性表达率明显高干术前（P〈0．05）；20例健康志愿者无一例阳性表达，胃腺癌细胞株BCK-823均为阳性表达。结论CK20mRNA作为标志物用于检测胃癌的血循环微转移是可靠的；手术操作可促使肿瘤细胞释放入血。