简介:目的研究Tob基因在胶质瘤细胞系SHG-44中的功能,为下一步进行试验性治疗提供依据.方法按照Tob基因的GenBank登录号D38305,构建带有绿色荧光蛋白(GFP)和新型抗生素Zeocin抗性基因的pTracer-EF/V5-HisA表达载体.利用脂质体将上述表达质粒转入SHG44胶质瘤细胞.在各个不同的培养时段选择2、4、8、16、24、36、48h分别在倒置显微镜下观察,最后在48h时取未转染和转染的细胞大约105个作细胞涂片,进行荧光显微镜摄影和GFAP免疫组化染色分析.同时作体外生长曲线和细胞周期的流式细胞术分析.结果酶切鉴定和序列分析均证实Tob基因被成功克隆,将此基因成功转染到SHG-44细胞后,荧光显微镜观察可见用4μg脂质体和2μgDNA,最后用10μg/mLZeocin筛选可以达到90%的阳性细胞数.在转染Tob基因成功的细胞中GFAP染色的阳性率也同样升高.细胞在转染了Tob基因以后生长速度明显变慢,几乎处于停滞状态.流式细胞术分析显示在体外培养24h后转染阳性细胞G2/M期比例明显减少,而凋亡细胞比例也出现明显的升高.结论Tob基因转染后的胶质瘤细胞生长受到明显抑制,出现向正常胶质细胞的分化和凋亡现象,提示Tob基因确实是一胶质瘤细胞增殖抑制基因,值得进一步做功能研究和实验性基因治疗研究.
简介:目的:研究小鼠舌肌发育的分子调控机制。方法:取胚胎第13.25天(E13.25)及E15.5小鼠舌组织。应用Affy-metrixMouseGeneChip,对胎鼠舌发育过程中的差异基因进行筛选。应用DAVID网络分析工具对基因进行功能和聚类分析。结果:基因功能和聚类分析表明,在E13.25高表达的基因主要与细胞周期相关因子(Exo1、Gsk3B、Kif20b、Skp2)和细胞粘附因子(Neo1、lama1)等相关。在E15.5高表达的基因主要与细胞骨架(titin、Hspb7)相关。结论:小鼠舌组织增殖和特化与细胞周期和细胞粘附基因相关,舌组织分化和成熟主要与细胞骨架相关。
简介:肿瘤的发生是一种复杂的生物学过程,癌基因激活和抑癌基因失活是肿瘤发生发展的基础。1997年不同的研究小组分别用不同的方法发现了抑癌基因PTEN(geneofphosphateandtensionhomologydeletedonchromsometen)[1-2],该基因是继p53基因后,另一种与多种系统肿瘤的发生有密切关系的基因[3-5],被认为是未来基因治疗的潜在途径,自发现以来一直是国内外研究的热点。近年来研究发现,PTEN基因的功能不仅局限于抑癌作用;针对该基因及蛋白的基因型和非基因型调控研究,亦有更深入的发现。本文现对PTEN基因功能及其调控的研究进展作一综述。
简介:目的研究银屑病特异表达microRNA(miRNA)与靶基因及基因功能之间调控网络及作用机制。方法采用基因芯片技术筛选银屑病皮损组织和健康皮肤组织中差异性表达的miRNA,并通过生物信息学对差异表达的miRNA进行靶基因预测及靶基因功能富集分析,构建银屑病差异表达miRNA与靶基因及基因功能调控网络,得到网络核心调控的miRNA和受调控作用的核心靶基因及关键性基因功能。结果得出银屑病皮损组织中明显上调的关键miRNA10个,调控的关键基因12个,主要功能21项,明显下调的关键miRNA21个,调控的关键基因22个,主要功能28项结论特异性表达的miRNA主要调控的靶基因及其基因功能与银屑病发病密切相关,为银屑病基因层面的机制研究提供了有效的依据。
简介:摘要目的构建人干扰素基因刺激因子(stimulator of interferon genes, STING)沉默子的荧光素酶报告质粒,在人胚肾细胞(HEK293T)和人类宫颈癌细胞(HeLa)中检测荧光素酶活性,生物信息学预测其可能结合的转录因子并通过实验验证。方法通过PCR扩增人STING-5-1a(-124~+267,相对于转录起始位点,TSS: 0)和STING-5-2a(-124~+168)区域,亚克隆至pGL3-Basic质粒;将人STING沉默子区域STING-5-1b(+169~+267)正向反向亚克隆至pGL3-Control质粒(pGL3-C-5-1b-positive/negative),并把STING-5-1b分为两段互补片段,亚克隆至pGL3-Control载体上,命名为pGL3-C-STING-5-1b-α(+169~+209)/pGL3-C-STING-5-1b-β(+210~+267),双荧光素酶报告活性分析检测上述重组质粒在HEK293T和HeLa中的活性。应用生物信息学方法预测人STING沉默子的转录因子结合位点,将预测结合位点进行多点突变,检测荧光素酶活性。敲低转录因子,免疫印迹试验检测STING的表达水平。染色体免疫共沉淀反应进一步验证转录因子与人STING沉默子的结合。结果核酸测序证实,上述重组质粒构建成功。截短STING-5-1b(+169~+267)片段后相对荧光素酶活性上升。同时,与pGL3-Control质粒相比,pGL3-C-5-1b-positive重组质粒的相对荧光素酶活性下降(P<0.05),其中,STING-5-1b-β(+210~+267)序列起主要抑制作用。应用生物信息学软件预测发现转录因子PR结构域锌指蛋白4(PRDM4)、Thanatos相关蛋白1(THAP1)、TEA域转录因子1(TEAD1)、核受体亚家族4 A组成员1(NR4A1)、类Krueppel因子4(KLF4)和叉头转录蛋白O3(FOXO3)可能与人STING沉默子区域(+210~+267)结合。对上述转录因子的结合位点进行多点突变构建突变体并转染至HEK293T和HeLa,发现THAP1-Mut和TEAD1-Mut的相对荧光素酶活性显著上升,提示STING沉默子可能含有THAP1和TEAD1的结合位点。将转录因子THAP1和TEAD1敲低后,STING的表达水平有显著上升。染色体免疫共沉淀试验表明,转录因子TEAD1和THAP1在细胞内与人STING沉默子区域结合。结论本实验成功构建了人STING沉默子荧光素酶报告质粒,通过活性比较,推测人STING的核心沉默子区位于+210~+267区域,通过生物信息学分析及点突变实验初步确定人STING沉默子可能含有的潜在转录因子结合位点。并使用免疫印迹试验和染色体免疫共沉淀进一步证实转录因子TEAD1和THAP1与人STING沉默子的结合,为后续研究提供实验资料。
简介:目的:通过筛选小鼠下颌下腺发育起关键作用的基因,并预测其基因功能,为唾液腺组织工程奠定实验基础。方法:选取小鼠胚胎第18.5天、19.5天、出生后当天、出生后3天等4个不同时期的下颌下腺,进行基因芯片检测,BeadStation500System扫描仪(illumina,Inc.)对芯片扫描,然后采用BeadStudioGeneExpressionModule图像分析软件(illumina,Inc.)对芯片灰度扫描图进行分析,构建小鼠下颌下腺的全基因表达谱。应用生物信息学STC法分析基因表达趋势,建立发育时间与基因表达相关的调控网络图,从网络中筛选关键基因,预测其基因功能,并对关键基因Skp2进行实时荧光定量PCR验证。结果:应用STC生物学方法,得到差异基因的8种显著性表达趋势,其中有4种与表型相关。构建网络图筛选关键基因,得到Ddx1、Cenpl、Fanci、Skp2、Rbm4、Dak。Skp2基因检测数据与实时荧光定量PCR验证结果一致。其中Skp2与胚胎期细胞的分化、增殖密切相关。结论:6个关键基因在小鼠下颌下腺发育过程中起重要作用。
简介:SsDREB是从盐地碱蓬克隆获得的一个DREB2类转录因子,其表达受高盐和干旱诱导,而对ABA和低温处理反应不明显。本研究将SsDREB与绿色荧光蛋白(GFP)基因构建融合表达载体并在洋葱表皮细胞中进行瞬时表达,结果表明SsDREB编码蛋白定位在细胞核中;酵母转录激活实验证明,SsDREB能特异性结合DRE顺式作用元件,并激活下游报告基因的表达;采用农杆菌介导法将SsDREB基因在35S启动子的驱动下转入烟草中,获得的转基因植株对干旱和盐胁迫抗性均显著提高;为研究SsDREB过量表达提高转基因烟草抗旱、耐盐能力的分子机制,选取烟草中与提高质膜稳定性、消除活性氧和渗透平衡相关的8个逆境胁迫相关基因,以烟草α-tublin基因做为内参,利用半定量RT-PCR方法分析在正常生长条件下这8个基因在转基因烟草和对照烟草中的表达情况,实验结果表明这8个基因都受外源SsDREB基因的调控,其中6个基因在转基因烟草中的表达量显著高于非转基因植株。
简介:摘要目的探讨PAX2基因沉默对梗阻性肾病大鼠肾功能的影响。方法64只幼年雄性大鼠随机分为阴性对照组(NC)和沉默组(RNAi)各32只,均于转染后按照3、5、7、14 d分为4组,每组8只,留取血、尿和肾组织标本,实时定量聚合酶链式反应(real-time fluorescence quantitative PCR,Real-time PCR)检测肾组织PAX2 mRNA的沉默效果,全自动生化分析仪检测血肌酐与尿β2微球蛋白(β2-microglobulin,β2-MG)的含量。结果与对照组相比,3、5、7、14 d沉默组的PAX2 mRNA表达量均明显降低,差异具有统计学意义[(1.61±0.19)比(1.13±0.23),(1.81±0.37)比(1.22±0.34),(3.12±0.29)比(1.81±0.24),(4.12±0.46)比(2.07±0.33),t值分别是3.33、2.82、9.74、9.65,P值均<0.05],;对照组和沉默组各时间点(1、2、3、5、7、14 d)血肌酐水平有所波动,但差异无统计学意义[μmol /L:(43.03±8.55)比(45.65±9.43),(45.76±4.11)比(44.87±7.27),(45.40±8.73)比(47.53±5.72),(47.85±8.00)比(44.93±5.85),(47.45±7.13)比(50.47±6.78),(50.75±6.20)比(51.29±5.91),t值分别是0.58、0.30、0.58、0.83、0.89、0.18,P值均>0.05];两组尿β2-MG含量在1、2、3、5、7 d差异无统计学意义[ng/mL:(1.50±0.17)比(1.38±0.23),(1.53±0.20)比(1.40±0.26),(1.41±0.19)比(1.50±0.13),(1.90±0.48)比(2.17±0.59),(3.66±0.77)比(3.17± 0.96),t值分别是1.19、1.12、1.11、1.00、1.27,P值均>0.05],而第14 d对照组明显高于沉默组[ng/mL:(6.08±1.01)比(4.16±1.05),t=3.73,P<0.05)]。结论PAX2基因沉默在梗阻晚期可以降低单侧输尿管结扎(unilateral ureteral obstruction,UUO)大鼠尿中β2-MG含量,改善肾功能。